Análisis bioquímico y molecular de la ruta de la lipoxigenasa en relación a la generación del aroma del aceite de oliva virgen

Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología QuímicaEl aceite de oliva virgen (AOV) es un zumo natural de excepcionales propiedades organolépticas y nutricionales. El perfil metabólico del AOV responsable de su calidad nutricional, organoléptica y tecnológica está determinado por el nivel de ciertos componentes que pasan directamente del fruto al aceite, como los ácidos grasos, y por el nivel de otros componentes que se forman específicamente durante el proceso industrial de obtención del aceite, a partir de precursores presentes en el fruto por acción de distintas enzimas, siendo este el caso de los compuestos volátiles y fenólicos. El contenido final de estos metabolitos relacionados con la calidad del AOV está controlado por los niveles de expresión /actividad de los correspondientes genes/enzimas implicados en su biosíntesis, que dependen de la variedad de olivo (Kalua et al., 2007). La biosíntesis de la mayor parte de los compuestos volátiles del AOV se produce a través de la ruta de la lipoxigenasa, por la acción consecutiva de cuatro enzimas (Schreier, 1985), lipoxigenasa (LOX), hidroperóxido liasa (HPL), alcohol deshidrogenasa (ADH) y alcohol aciltransferasa (AAT). En proyectos anteriores del grupo se ha comenzado a estudiar el proceso de formación de los compuestos volátiles que caracterizan el aroma del AOV. Dentro del grupo se han aislado y caracterizado proteínas con actividad lipoxigenasa e hidroperóxido liasa (Padilla, Hernández, Sanz, & Martínez-Rivas, 2009)(Padilla, Hernández, Pérez, Sanz, & Martínez-Rivas, 2010)(Padilla, Hernández, Sanz, & Martínez-Rivas, 2012), y se han determinado los factores limitantes en la biosíntesis de los compuestos volátiles en el AOV (Sánchez-Ortiz, Romero, Pérez, & Sanz, 2008)(Sanchez-Ortiz, Romero-segura, Sanz, & Perez, 2012)(Sánchez-Ortiz, Pérez, & Sanz, 2013). La expresión del gen Oep2LOX2 a lo largo de la maduración guarda buena relación con el contenido en compuestos volátiles del AOV procedente de frutos con distinto grado de maduración; lo cual nos permite determinar su importancia en la formación de estos compuestos y nos informa de su regulación a lo largo de la maduración; pero no podemos descartar la contribución de otros genes LOX, que podrían estar regulados por otros factores. Este trabajo de investigación perseguía una serie de objetivos: ¿ Aislamiento, secuenciación y análisis de expresión de nuevos genes LOX de olivo. ¿ Caracterización de la variabilidad del olivo en relación con la fracción volátil del AOV. ¿ Caracterización metabólica, bioquímica y molecular de la biosíntesis de los compuestos volátiles del aceite en variedades de olivo seleccionadas. ¿ Caracterización metabólica, bioquímica y molecular de la biosíntesis de los compuestos volátiles del aceite en individuos seleccionados de un cruzamiento Picual x Arbequina. ¿ Caracterización funcional de la 13-hidroperóxido liasa de olivo en la biosíntesis de compuestos volátiles del aceite de oliva. Se ha clonación y caracterizado un gen (Oep3LOX2) que codifica una 13-lipoxigenasa de olivo. Se ha estudiado su expresión génica en diferentes tejidos, hoja, semilla y mesocarpo, a lo largo de la maduración del fruto y ante situaciones de estrés, como baja y alta temperatura, oscuridad, herida y estrés hídrico. Se ha observado que este gen está regulado tanto espacial como temporalmente y que presenta una clara respuesta ante situaciones de estrés por herida y por estrés hídrico. Se ha estudiado la variabilidad del perfil metabólico del olivo en relación con la fracción volátil del AOV en variedades de olivo de alta diversidad genética y líneas de olivo con fondo genético común. Se ha llevado a cabo el análisis de compuestos volátiles en aceites obtenidos de las variedades de la colección CN-36 del Banco Mundial de Germoplasma de Olivo de Córdoba, a lo largo de dos campaña, observándose una gran variabilidad. En la mayor parte de las variedades predominan los compuestos de seis átomos de carbono derivados del LnA, principales responsables del aroma del AOVDestaca también la variabilidad encontrada en el contenido de los compuestos de cinco átomos de carbono (C5) y de ésteres volátiles que también tienen una gran repercusión en el aroma del AOV. El mismo análisis se realizó en 136 genotipos de olivo obtenidos a partir de un cruzamiento Picual x Arbequina, a lo largo de tres campañas de recolección de fruto. La obtención y análisis de compuestos volátiles se realizó del mismo modo que para las variedades de la CN-36. Los resultados revelaron una gran variabilidad entre los individuos. La mayor parte de los compuestos volátiles de la progenie fueron compuestos de seis átomos de carbono derivados del ácido linolénico (C6/LnA). Entre este grupo de compuestos, los aldehídos fueron los más abundantes. Se ha realizado un estudio metabólico, bioquímico y de expresión génica a lo largo del período de maduración del fruto de la ruta de biosíntesis de volátiles en variedades de olivo genéticamente diferentes seleccionadas de la colección CN-36. Se seleccionaron siete variedades con perfil metabólico muy diferente, con alto, bajo y medio contenido en compuestos volátiles. Sobre estas variedades, a lo largo de la maduración del fruto, se ha realizado un estudio metabólico, bioquímico y de expresión génica. El contenido en compuestos volátiles de los aceites presentan en general un máximo cuando el fruto se encuentra en envero (estadio III). No se han encontrado correlaciones entre el contenido total de estos metabolitos y los de las principales actividades enzimáticas de la ruta de la LOX que determinan el perfil volátil de los aceites, LOX y HPL. Tan sólo se aprecia una correlación moderada (r = 0,51) entre la actividad LOX y el contenido de compuestos C6/LA, aunque no se ha encontrado ninguna correlación con el contenido de los compuestos C6/LnA, compuestos mayoritarios en la fracción volátil del AOV, lo que sugiere que la disponibilidad de LnA libre durante el proceso de elaboración del aceite es el factor determinante del contenido final de compuestos C6/LnA en los aceites. Tampoco la actividad HPL muestra ningún tipo de correlación con este grupo de compuestos mientras que, como cabría esperar, la correlación es negativa con el contenido de compuestos C5 de LnA y LA (r = -0,33; r = -0,24). En cuanto a la actividad ADH, se ha encontrado que muestra un grado moderado de correlación con el contenido de sus productos de reacción, tanto en sentido reductor formando alcoholes C6/LnA (r = 0,49), como en sentido oxidativo dando lugar a carbonilos C5/LnA (r = 0,52) y C5/LA (r = 0,55). Por último, el nivel de actividad AAT muestra en general unos valores medios y una evolución muy similar en las siete variedades seleccionadas, aunque con ciertas características para cada variedad. En cuanto al nivel de expresión de genes relacionados con la síntesis de los compuestos responsables de las características del aroma del AOV, el gen Oep3LOX2 muestra el mayor grado de correlación entre los genes LOX estudiados con el contenido en compuestos C6/LA (r = 0,66), siendo inexistente para la del gen Oep2LOX2. El nivel de expresión de Oep3LOX2 es, entre los genes LOX estudiados, el que mejor se relacionaba con el nivel de actividad LOX (r = 0,42). Por otra parte, se ha encontrado una correlación significativa pero negativa entre el contenido en compuestos C5 y el nivel de expresión de 2LOX2 que indicaría que este gen, más bien su producto el enzima 2LOX2, no estaría implicado en la síntesis de compuestos C5, como ya se había sugerido en estudios anteriores. El perfil de expresión del gen HPL a lo largo de maduración del fruto es muy parecido en general para todas las variedades, caracterizado por un descenso del mismo y correlacionando significativamente con el contenido en aldehídos C6/LA (r = 0,48). Sin embargo, no se ha encontrado correlación con los niveles de actividad HPL lo que podría ser debido a las características constitutivas de su expresión durante la maduración de la aceituna y la diferencia temporal entre expresión del gen y síntesis de la proteína. Se ha llevado a cabo un estudio metabólico, bioquímico y de expresión génica a lo largo del período de maduración del fruto de la ruta de biosíntesis de volátiles en individuos con fondo genético común derivados del cruzamiento Picual x Arbequina. El estudio se ha realizado exclusivamente en el tejido de mesocarpo mediante la aproximación de los homogenizados dado que no había cantidad de fruto suficiente para producir aceite. En general se observa que el contenido en compuestos volátiles obtenidos en los homogenizados del mesocarpo presentan un discreto máximo cuando el fruto se encuentra en envero (estadio III), siendo la línea 5/12 la que da lugar a los niveles más altos de compuestos volátiles mientras que la línea 54/44 da lugar a menores contenidos, aproximadamente el 50% de la primera. En este sentido, se han encontrado correlaciones moderadas entre el contenido total de compuestos volátiles y las principales actividades enzimáticas de la ruta LOX que determinan el perfil volátil de los aceites, LOX (r = 0,32) y HPL (r = 0,43), que se deben fundamentalmente a la significativa correlación con el contenido de compuestos C6/LA [LOX (r = 0,63) y HPL (r = 0,75)]. En cuanto a la actividad ADH, a diferencia de lo que se ha encontrado en las variedades, sólo se ha verificado un grado relativamente alto de correlación con el contenido de alcoholes C6/LA (r = 0,62). Por último, el nivel de actividad AAT muestra unos valores medios y un patrón de evolución durante la maduración poco definidos en los cinco genotipos seleccionados. En general, los niveles de actividad son más semejantes entre sí que en el caso de las variedades, aunque el nivel medio es muy similar, en torno a 1 U/g fruto. En cuanto al nivel de expresión de genes relacionados con la síntesis de los compuestos responsables de las características de calidad aromática del AOV, se ha encontrado que, como en el caso de las variedades, la expresión de Oep2LOX2, no sería un factor determinante en la síntesis de compuestos C6. Como ocurría con las variedades, el contenido de compuestos C6/LnA parece estar más relacionado con el nivel de expresión del gen Oep3LOX2 (r = 0,28). Por otra parte, se ha encontrado que el perfil de expresión del gen HPL a lo largo de maduración del fruto es en general muy parecido entre los genotipos seleccionados con un descenso paulatino durante el proceso de maduración, presentando un nivel de correlación moderado (r = 0,29) con los niveles de actividad HPL en el fruto. Por último, se ha realizado un estudio de caracterización genómica funcional de hojas transgénicas de olivo. En colaboración con el grupo del profesor D. Fernando Pliego de la Universidad de Málaga, se ha llevado a cabo un ensayo de genómica funcional de olivo empleando tanto la técnica antisentido como mediante RNA interferente. Se ha realizado un análisis de expresión génica, niveles de actividad enzimática y de metabolitos en las hojas procedentes de las líneas de olivo transgénico. Los datos de expresión génica revelaron que las líneas interferentes presentaban una fuerte represión de la expresión del gen OeHPL en comparación con las líneas control, las líneas de sobreexpresión presentaban a su vez mayor expresión génica de dicho gen mientras que las antisentido presentaban una ligera represión de la expresión génica. El análisis de la actividad enzimática HPL mostró la misma tendencia que los datos de expresión génica, no encontrándose actividad en las líneas silenciadas con RNA interferente, una mayor actividad con respecto al control en las líneas que presentaban sobreexpresión del gen y un descenso de actividad en aquellas que presentaban silenciamiento por antisentido. El análisis de compuestos volátiles reveló una fuerte represión de los compuestos C6 tanto del LA como del LnA y un aumento muy elevado de los compuestos C5, tanto C5/LnA como C5/LA, en las líneas que presentaban silenciamiento génico por RNA interferente. En las líneas que presentaban sobreexpresión se observó un ligero aumento de los compuestos C6/LnA y C6/LA, mientras que en las líneas con silenciamiento antisentido no se observó disminución de los compuestos C6 pero sí se produjo un ligero aumento en los compuestos C5.Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería BioquímicaPostprin