Role of Pax4 and Pax8 in pancreatic islets physiology and patophysiology

Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología QuímicaLa Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad metabólica crónica, caracterizada por hiperglucemia debida a un déficit absoluto o parcial en la secreción de insulina por parte de las células ß pancreática. La etiología deriva bien de una destrucción autoinmune de las células ß productoras de insulina (DM Tipo 1; DMT1) o a una combinación entre la resistencia a insulina de los tejidos diana y la secreción insuficiente de insulina por las células ß (DM Tipo 2; DMT2) (1). Un tercer tipo de diabetes, la diabetes gestacional (DMG), se produce cuando durante el embarazo la producción de insulina materna es insuficiente para compensar el incremento de la demanda de esta hormona causado por el desarrollo fetal. Los tratamientos actuales mejoran la calidad de vida pero no evitan las graves complicaciones secundarias (uso inadecuado de la insulina) para el estado de salud general del paciente, o son insuficientes (trasplante clínico de islotes). Más aún, tratamientos alternativos que están en vías de desarrollo están resultando difícilmente reproducibles (células madre progenitoras). Además, estudios epidemiológicos recientes indican que pacientes con DMT2 tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer pancreático, hepático, colorrectal y de mama, deteriorando aún más el estado de salud (2). Alarmantemente, la DM ha alcanzado dimensiones pandémicas. Se prevee que en el año 2030, el 9,9% de la población adulta mundial tendrá diabetes (551 millones de personas) lo que la convierte en la quinta causa de muerte en el mundo (3,4). Esto supone una importante carga económica para los servicios de salud; en 2011, los costes sanitarios debidos a la DM se calcularon en 465 billones de dólares (11% del gasto sanitario) (5). En España, la prevalencia de esta enfermedad supone el 14% (estudio di@bet.es) siendo la octava causa de muerte en nuestro país con un 8% de mortalidad. Concretamente, nuestra comunidad se encuentra entre las tasas más altas de prevalencia a nivel nacional con un 12% alcanzándose en Sevilla un 10,2% (6). En conjunto, todos estos datos ponen de manifiesto la gran necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas innovadoras encaminadas a preservar o reponer la masa de células ß funcionales en pacientes diabéticos que es lo que se conoce con el concepto de regeneración in vivo. Por tanto, el abordaje terapéutico definitivo para el tratamiento de la DM debería tener como objetivos: 1) bloquear la destrucción de las células ß, 2) reemplazar o regenerar las células ß y 3) preservar la masa y funcionalidad de las células ß. En este fin radica la importancia de este proyecto en el que investigamos la función fisiológica y los mecanismos moleculares subyacentes regulados por los factores de transcripción Pax4 y Pax8 como potenciales agentes clave para una terapia regenerativa de cara al desarrollo de un tratamiento óptimo e innovador para la DM: OBJETIVO 1: determinar el papel fisiológico del factor de transcripción Pax8 en la fisiología del islote pancreático con el fin de caracterizar un nuevo regulador de la plasticidad de dichos islotes durante el embarazo. ANTECEDENTES, METODOLOGÍA Y RESULTADOS OBTENIDOS: varios estudios independientes han detectado Pax8 en islotes humanos y en tumores pancreáticos neuroendocrinos humanos (PNET, pancreatic neuroendocrine tumor) sugiriendo su utilidad como biomarcador de este tipo de tumores (7-9). Sin embargo, recientemente, hemos demostrado la ausencia de expresión de Pax8 en islotes de ratón tanto durante el desarrollo embrionario como en páncreas adulto, mientras que en islotes humanos se encontraron niveles muy bajos. Adicionalmente, en colaboración con las Dras. Rocío Carbonero y Lourdes Gómez (oncóloga y patóloga, respectivamente, del Hospital Virgen del Rocío), tampoco detectamos expresión de este factor de transcripción en PNETs humanos (10,11). Estos datos descartan Pax8 como marcador clínico para la identificación y diagnóstico precoz de este tipo de tumores. No obstante, un estudio de asociación de todo el genoma ha asociado Pax8 con DM tipo 2 en familias afroamericanas (12). Además, una determinación del perfil transcriptómico llevada a cabo en islotes aislados de hembras de ratón embarazadas reveló una fuerte inducción en los niveles de expresión de Pax8 durante la gestación (13). Corroborando este resultado, una mutación en Pax8 que causa hipotiroidismo congénito en tres generaciones de una familia de las Azores, ha sido recientemente asociada con diabetes gestacional leve en uno de los miembros femeninos portadores de esta mutación (14). En conjunto, estos datos clínicos sugieren que Pax8 podría influir en la fisiología del islote bajo condiciones metabólicas específicas tales como el embarazo. Por tanto, para dilucidar el papel funcional de la expresión de Pax8 en islotes de ratón y humanos durante el embarazo, confirmamos en primer lugar que su expresión se incrementaba en islotes de ratón durante el embarazo, alcanzándose a día 14.5 de gestación niveles máximos de expresión de hasta 5 veces superiores que en islotes control. También encontramos que la expresión de Pax8 en islotes humanos aumentaba 5 veces tras 72h de tratamiento con prolactina, hormona utilizada para simular el embarazo en islotes humanos en cultivo. Para determinar la correlación entre la expresión de Pax8 y la proliferación celular, analizamos los niveles de proliferación en islotes humanos en cultivo tras el tratamiento con prolactina. Observamos un aumento transitorio en la proliferación de dichos islotes, incrementándose un máximo de 2 veces tras 48h, de manera que no correlaciona con el máximo de expresión de Pax8. Esto sugiere que este gen puede no estar implicado en replicación celular, sino más bien en la represión de dicha proliferación. Estos datos indican claramente que la expresión de Pax8 puede inducirse en islotes bajo condiciones fisiológicas específicas que suponen un estrés metabólico tales como el embarazo. PERSPECTIVAS FUTURAS: para analizar directamente el papel de Pax8 en la proliferación de los islotes, nuestros futuros planes son evaluar el efecto de la sobre-expresión de este factor de transcripción tanto en islotes humanos y de ratón, como en líneas celulares derivadas de insulinoma. Esta sobreexpresión de Pax8 (ratón y humano) se realizará mediante infección de los islotes con un vector lentiviral creado en nuestro laboratorio. Estos estudios determinarán si Pax8 afecta la proliferación sólo o en combinación con prolactina, o si está implicado en reprimir la proliferación mediada por prolactina. En este último supuesto, silenciaremos Pax8 para analizar el impacto sobre la proliferación. Además (basándonos en los datos preliminares en humanos), intentaremos corroborar que las mutaciones en Pax8 se asocian con DMG. Para ello, se llevará a cabo un screening entre mujeres portadoras de mutaciones en Pax8 en el que se les realizará un análisis clínico retrospectivo para comprobar si algunas de ellas padecieron DMG durante el embarazo. RESULTADOS PREVISTOS (IMPACTO SOCIAL): el objetivo y fin último de nuestro estudio es que, a partir del cribado genético para Pax8, se podrá usar este marcador para determinar la susceptibilidad de desarrollar DMG entre la población femenina. Esto permitirá un seguimiento y/o tratamiento de la población de riesgo para, de esta forma, disminuir la incidencia de DMG. OBJETIVO 2: descifrar los mecanismos moleculares regulados por Pax4 con el fin de obtener nuevos genes y rutas metabólicas implicadas en la regeneración y supervivencia de la célula ß pancreática. ANTECEDENTES, METODOLOGÍA Y RESULTADOS OBTENIDOS: en nuestro laboratorio, mediante el uso de un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa Pax4 en las células ß tras un tratamiento con doxiciclina, hemos demostrado que Pax4 protege a este tipo celular frente a apoptosis inducida por estreptozotocina y el consiguiente desarrollo de hiperglucemia (15). Para elucidar los mecanismos por los cuales Pax4 transfiere un fenotipo propenso a la protección, llevamos a cabo un análisis comparativo por microarray de DNA en los islotes de los ratones transgénicos que sobreexpresan Pax4 frente a los que no lo expresan. Los datos del microarray revelan que 770 transcritos estaban aumentados mientras que 505 disminuyeron. Se realizó un enriquecimiento funcional para identificar las vías de señalización significativamente enriquecidas en islotes que sobreexpresaban Pax4 comparándolos con los que no lo expresaban. Tres rutas sobresalieron particularmente en los animales que sobreexpresan Pax4: ciclo celular, p53 y cáncer (rutas KEGG), todas ellas relacionadas directamente con supervivencia celular y proliferación. En cuanto a los genes implicados en el ciclo celular, destacan las ciclinas A2, B2 y D1 las cuales promoverían la replicación. Notablemente, el Gen Inducible por Mitógeno (Mig6) y el inhibidor 1A de las ciclinas dependientes de kinasa, p21, dos ¿frenos¿ moleculares de las vías pro-proliferativas, estaban entre los genes más aumentados. Estos datos sugieren que, aunque las células del islote que expresan Pax4 estén listas para proliferar/sobrevivir, probablemente factores como Mig6 y p21 están reteniendo esas capacidades a menos que sean activadas por determinadas señales fisiológicas. Además, la glutatión peroxidasa 3 (GPX3) fue también uno de los genes más incrementados pudiendo desempeñar un papel clave en la protección de los islotes contra la apoptosis inducida por estrés oxidativo. PERSPECTIVAS FUTURAS: nuestros futuros planes son el análisis de expresión por técnicas moleculares de PCR cuantitativa a tiempo real y análisis inmunohistoquímico de diferentes ciclinas, c-myc, Mig6, p21, p53 y GPX3, entre otros, en islotes de ratones que sobreexpresan Pax4 y de ratones control. Estos estudios elucidarán la ruta metabólica por la cual actúa y ejerce su acción Pax4 en las células ß de los islotes pancreáticos, así como genes modulados por este factor de transcripción y que pueden ser utilizados como potenciales diana para el desarrollo de tratamientos contra la DM. RESULTADOS PREVISTOS (IMPACTO SOCIAL): en definitiva, nuestro objetivo es comprender en detalle la función de Pax4 en la fisiología del islote con el fin de desarrollar nuevos fármacos basados en este factor de transcripción y/o sus dianas mejorando así los tratamientos actuales para la DM.Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímic