Implementación de un sistema modelo diploide/tetraploide para el estudio genético y molecular de la apomixis en Paspalum rufum

La apomixis es un modo de reproducción asexual por semillas que genera progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Esta característica es común en especies del género Paspalum, donde las poblaciones naturales se organizan en complejos agámicos multiploides. En estos sistemas, el citotipo diploide se reproduce por sexualidad, mientras que los polipoloides, generalmente triploides y tetraploides, se reproducen por apomixis gametofítica de tipo apospórica pseudógama. A pesar de esto, en varias especies del género, en especial en P. rufum, se detectaron individuos diploides que producen sacos embrionarios apospóricos (SEA) e incluso algunos son capaces de completar la apomixis. El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de estudio de la apomixis a nivel diploide y tetraploide en P. rufum. Para esto se trabajó en la generación y caracterización del material vegetal, se estableció un sistema comparativo y se desarrollaron herramientas moleculares para futuros estudios sobre los genes asociados al control de los componentes del carácter. En primer lugar, se realizó una caracterización de la transmisión de los componentes de la apomixis, aposporía (SEA) y partenogénesis al nivel diploide. Se trabajó con una población segregante F1 proveniente del cruzamiento entre dos genotipos diploides naturales, ambos capaces de producir SEA en proporciones similares (5,77 %SEA y 13 %SEA) y con capacidad diferencial de completar la partenogénesis (0% y 15%). Los análisis de segregación del carácter “aposporía”, realizados mediante observaciones citoembriológicas, ajustaron a un modelo dominante controlado por dos loci independientes. La determinación del %SEA en la progenie F1 (entre 0% y 35,8 %SEA) reveló que la hibridación puede aumentar significativamente la expresividad del carácter. Por otro lado, se confirmó que el grado de expresividad de la aposporía se transmite desde los parentales a las progenies (F2) y es un carácter estable para un mismo genotipo a lo largo del tiempo, sin embargo varía en diferentes ambientes. La capacidad de formar semillas por apomixis fue evaluada en varios individuos mediante citometría de flujo y se demostró que si bien algunos producen semillas apomícticas, la mayor expresividad de la aposporía no se correlaciona con esta capacidad. Además, se analizó la influencia del aumento de ploidía, en genotipos tetraploides artificiales, sobre la expresividad de la aposporía y la apomixis. Estos análisis mostraron que la duplicación genómica permite incrementar el %SEA y la apomixis aunque esta no prevalece sobre la sexualidad. Para avanzar con el desarrollo de herramientas moleculares se utilizó la población F1 para generar un mapa de ligamiento genético a nivel diploide. Se construyeron dos mapas de ligamiento mediante la inclusión de 627 marcadores de AFLP. Cada mapa quedó formado por 10 grupos de ligamiento (GL) cubriendo una longitud total de 1071,8 cM y 914 cM con una distancia promedio entre marcadores de 4,78 cM y 4,53 cM y una distancia máxima entre dos marcadores de 28,74 y 34,8 cM para el parental femenino y masculino, respectivamente. La variación observada para la expresividad de la aposporía en la población nos llevó a realizar una búsqueda de regiones asociadas a la misma mediante análisis de regresión simple. Se comprobó la existencia de más de una región genómica asociada al carácter, localizadas principalmente en dos GL. Si bien se desconocen las vías moleculares que controlan la apomixis se ha postulado que su expresión es posible gracias a la desregulación de los mismos genes que participan en el desarrollo sexual y provocan una heterocronía en los procesos de desarrollo reproductivo. Con el objetivo de probar esta hipótesis se comparó el desarrollo reproductivo sexual y apomíctico entre los citotipos diploide y tetraploide, ambos con sexualidad y apomixis en diferentes proporciones. Se evaluó la evolución de la esporogénesis y la gametogénesis femenina y masculina, el crecimiento del ovario y la diferenciación de las células iniciales de la aposporía (IA). Estos análisis mostraron diferente coordinación entre los procesos de desarrollo sexual y apomíctico en el citotipo diploide respecto del tetraploide, observándose principalmente un retraso de la meiosis femenina en los tetraploides. Se postula que esta característica podría estar favoreciendo al desarrollo apomíctico al nivel poliploide. Considerando la relación que existe entre las modificaciones epigenéticas y la expresión de la apomixis se realizó un análisis comparativo de los perfiles de metilación entre genotipos diploides, de la población F1, con diferentes %SEA, utilizando espiguillas en premeiosis y postmeiosis. Se aplicó una técnica desarrollada recientemente denominada MCSeEd. Este análisis reveló la presencia de cambios en la metilación asociados a los diferentes comportamientos reproductivos. Se verificó además que varias de las secuencias diferencialmente metiladas poseen homología con genes relacionados con procesos de crecimiento y desarrollo reproductivo. Los resultados obtenidos en la presente tesis permitieron caracterizar exhaustivamente el desarrollo de la apomixis a nivel diploide y tetraploide en la especie P. rufum. Se desarrolló el material vegetal diploide y tetraploide para continuar con los estudios moleculares de la apomixis y comprender su control, así como la influencia que ejercen los aumentos en los niveles de ploidía. Se construyó un mapa de ligamiento que será el punto de partida para localizar los componentes de la apomixis en el genoma diploide. Por último, se implementó el sistema diploide para un primer estudio comparativo a nivel molecular identificándose variaciones epigenéticas relacionadas con el cambio del comportamiento reproductivo. Además, se generó una base de datos de secuencias que serán de gran utilidad en estudios posteriores para la identificación de los genes que intervienen en la regulación de la apomixis a nivel diploide.Apomixis is an asexual mode of reproduction by seeds that generates maternal clonal progeny. Although the character is mainly expressed at polyploid level, components of apomixis have been detected at the diploid level in several species of Paspalum, including P. rufum. The objective of this work was to establish a comparative system for studying apomixis at diploid and tetraploid levels in P. rufum. The activities performed include the generation and characterization of the plant material, as well as, the development of molecular tools for further analyses of genes controlling apomixis components. The trans-generational transmission of apomixis components, apospory (AES) and parthenogenesis, was analyzed in a segregating F1 population obtained by crossing diploid genotypes producing similar proportions of AES (5.77% and 13%), but having different capacity to complete parthenogenesis (0% and 15%). Cytoembryological observations revealed that apospory segregates as a dominant character controlled by two independent loci. Quantification of %AES showed that hybridity can increase it up to 35.8% and is transmitted to successive F2 generations. Tetraploid genotypes artificially obtained revealed higher %AES than its diploid counterparts. The evaluation of apomixis capacity by flow cytometry in diploid hybrids showed that it is transmitted to the progeny, however a high %AES is not enough to guarantee apomixis expression. Artificial tetraploid genotypes also increase apomixis capacity in comparison to its original diploids but it varied depending on original diploid genotypes. A genetic linkage map at diploid level was built in order to characterize the P. rufum genome and search regions associated with expressivity of apospory. Two linkage maps with ten linkage-groups (LG) were constructed for each parental genotypes covering a recombination distance of 1071.8 cM (maternal) and 914 cM (paternal), respectively. A single regression analysis allowed to find more than one genomic region modifying the character. Reproductive development was characterized by cytoembryological observations of ovaries and anthers during reproductive development. This assay showed a delay of female reproductive development in tetraploid cytotype with respect to diploid cytotype, mainly at meiosis. This behavior could favor apomixis development at the tetraploid level. An epigenetic comparative analysis between diploid plants with low and and high %AES was performed by applying the new MCSeEd technique. Results revealed that different methylation patterns are related with reproductive development. Sequences differentially methylated showed homology with genes related to growth and reproductive development. Results obtained in this work contribute to generate the vegetal material for characterizing apomixis and establishing a comparative system at both diploid and tetraploid levels. The diploid system and the genetic linkage maps developed, as well as, the methylation analysis performed will help for disclosing apomixis components operating in P. rufum.Fil: Apellido, Nombre. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaSoliman, Mariano. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentin