Aportes de prolina deshidrogenasa a la defensa contra patógenos en arabidopsis

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017El metabolismo de prolina (Pro), ha sido ampliamente estudiado en condiciones de estrés abiótico, donde la síntesis y el catabolismo son regulados en paralelo generando un incremento de Pro que generalmente, aumenta la tolerancia a las condiciones desfavorables. Recién en el año 2011 se describió que este metabolismo, también participa positivamente en las defensas contra patógenos con estilo de vida biótrofa. En este caso, se observó que la enzima Pro deshidrogenasa (ProDH), es requerida para la resistencia contra bacterias que son contrarestadas mediante el desarrollo de una Respuesta Hipersensible (HR), en la que se genera un incremento de especies reactivas del oxígeno (ROS)y muerte celular. ProDH es la enzima limitante del catabolismo de Pro que tiene lugar en la mitocondria. En Arabidopsis se encuentra codificada por dos genes, ProDHl y ProDH2. Hasta el momento, todas las funciones que se le han asignado a esta enzima son desarrolladas por la isoforma 1. ProDH2 ha sido muy poco estudiada habiéndose descripto recientemente que es una enzima funcional. Los genes ProDH son diferencialmente regulados a nivel tisular y en respuesta a distintos estreses abióticos, presentando un bajo grado de co-expresión. Las interacciones con patógenos constituyen una de las pocas condiciones que activan al gen ProDH2 y aumenta la co-expresión con ProDH1. Conociendo que plantas silenciadas en ambos genes ProDH reducen el desarrollo de la HR contra Pst-AvrRpml, uno de ellos o ambos podrían ser reponsables de este fenotipo. Además, ProDHl y ProDH2 podrían participar diferencialmente en interacciones con patógenos de distinta naturaleza. Nos propusimos evaluar la participación de cada gen ProDH en la inmunidad contra biótrofos y necrótrofos, así como los factores que regulan su expresión en esas condiciones. Al infectar simples mutantes prodhl y prodh2, con Pst- AvrRpml, Pst DC3000 (hemibiotrófos avirulento y virulento, respectivamente) y B. cinerea (necrótrofo virulento) detectamos que ambos genes son necesarios para activar la resistencia contra todos estos patógenos. Sin embargo, la mutante prodh2 tiene mayor susceptibilidad al hongo necrótrofo que la mutante prodhl, evidenciando la primera condición de estrés en la cual ProDH2 tiene mayor relevancia que ProDH1. En condiciones de infección los dos genes ProDH responden a distintos factores. ProDHl es regulado por SA y por el balance de SA y ácido jasmónico (JA), mientras que ProDH2 responde sólo a JA. A su vez, describimos la existencia de inter-regulación a nivel transcripcional entre estos genes que manifiesta distintos rasgos en condición basal y en infección. Estos resultados indican que las isoformas ProDHl y ProDH2 no cumplirían funciones redundantes pero si probablemente RESUMEN 13 complementarias durante la infección con patógenos microbianos. Este es el primer reporte de la contribución relativa de cada isoforma de ProDH en una condición de estrés. En algunas condiciones de estrés abiótico, la síntesis y el catabolismo de Pro se activan en distintas partes de la planta (hojas, raíz). Para conocer si esto se reproduce en la infección, evaluamos la procedencia de la Pro degradada por ProDH. Observamos que ésta es generada en el tejido infectado por estimulación de la síntesis. Además, detectamos que ProDH puede activar las dos vías anabólicas de Pro conocidas. Estas utilizan a glutamato (Glu) u ornitina (Orn) como precursores. La segunda enzima del catabolismo de Pro 18-pyrrolina-Scarboxilato (PSC) deshidrogenasa (PSCDH) no es determinante para la acumulación de Pro pero si para la selección de la vía de síntesis a partir de Glu. Resultados similares se obtuvieron en condiciones de estrés abiótico por exposición a Pro exógena. El uso de Orn como precursor en la síntesis de Pro resultó novedoso, ya que esta vía no se había detectado activa en estadio de planta adulta ni en estrés. Dado que el ROSapoplástico (aROS) señaliza la resistencia contra patógenos biótrofos y que ambas ProDHs potencian la actividad de la NADPH oxidasa de membrana comenzamos a evaluar cómo la enzima mitocondrial afecta a la de membrana plasmática. En particular, estudiamos si esto involucra alteraciones del balance NADP+/NADPH del citosol. Observamos que ProDHl y ProDH2 modulan la homeostasis redox de esta dupla en respuesta a elicitores. La coordinación de ambas ProDHs con las vías de síntesis y su efecto sobre la homeostasis redox, sugiere que en tejidos infectados se estaría transportando poder reductor desde el citosol a la mitocondria pudiendo participar .asf de la regulación redox de ambos compartimentos. Estas alteraciones podrían ser determinantes para estimular a la NADPH oxidasa de membrana, y con ello la resistencia contra patógenos. Estos hallazgos establecen un nuevo enfoque para el estudio del mecanismo de acción de ProDH en la inmunidad vegetal.Rizzi, Yanina Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Cabrera, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina.Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Virgolini, Miriam Beatriz. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina.Drincovich, Maria Fabiana. Universidad Nacional de Rosario. Facultad Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentina