Biomarcadores ópticos para el diagnóstico de la osteoartritis utilizando la espectroscopía Raman

Programa Oficial de Doutoramento en Biotecnoloxía Avanzada. 5012V01[Resumen] La osteoartritis o artrosis (OA) es la enfermedad reumática más frecuente, caracterizada por la degradación progresiva del cartílago articular, la esclerosis subcondral y la inflamación de la membrana sinovial. Es asintomática en sus primeras fases, y el método de diagnóstico estandarizado en clínica, la radiografía, evalúa cambios en el tejido óseo adyacente al cartílago, limitando el diagnóstico a etapas de la enfermedad de moderadas a severas. La espectroscopía Raman (ER) ha sido descrita como una técnica no destructiva y libre de marcaje para detectar cambios moleculares en tejidos biológicos, generando una huella dactilar molecular del tejido analizado. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es evaluar el potencial de la espectroscopía Raman como técnica de diagnóstico de OA, identificando biomarcadores ópticos en un modelo ex vivo de cartílago articular humano. Para ello, se obtuvieron espectros Raman de explantes de cartílago humano procedente de cadera o rodilla, con un láser con longitud de onda (λ) de 785 nm, 50 mW, 120 acumulaciones, y una resolución de 4 cm-1. En base a ratios de las principales señales de los espectros obtenidos se constituyó una propuesta de perfil biomarcador, cuyos parámetros se analizaron cuantitativamente tomando como referencia el grado radiológico de Kellgren-Lawrence (K-L), el Sistema de Graduación Histológico-Histoquímico de Mankin (MS) y la cuantificación bioquímica de glucosaminoglicanos (GAGs) sulfatados y colágeno. Como resultado, se obtuvo un conjunto de parámetros Raman que están directamente relacionados con eventos que ocurren a nivel molecular durante la progresión de la OA, de los cuales se seleccionaron SGAGs (GAGs sulfatados), ColD/F (Colágeno defectivo/funcional) y GMF (Grado de mineralización por fosfato) para constituir modelos predictivos de la severidad de esta enfermedad. Estos parámetros permitieron la diferenciación de 2 perfiles en las muestras analizadas: un perfil de “baja severidad” (K-L 0-II y MS 0-8) y otro de “elevada severidad” (K-L III-IV y MS 9-13). Los modelos predictivos constituidos, tomando como variables respuesta tanto el grado K-L como el MS, fueron buenos, obteniendo valores de área bajo la curva (AUC) superiores a 0,8. Como conclusión general, se demostró que la ER permite diferenciar distintos grados de severidad de OA, mediante el estudio de ratios de señales de la huella molecular del cartílago. Se confirma de esta forma su potencial como herramienta diagnóstica complementaria de la OA.[Resumo] A osteoartrite ou artrose (OA) é a enfermidade reumática máis frecuente, caracterizada pola degradación progresiva da cartilaxe articular, a esclerose subcondral e a inflamación da membrana sinovial. É asintomática bas súas primeiras fases, e o método de diagnóstico estandarizado na clínica (radiografía) avalía cambios no tecido óseo adxacente á cartilaxe, limitando o diagnóstico a etapas da enfermidade dende moderadas a severas. A espectroscopía Raman (ER) é descrita como unha técnica non destructiva e libre de marcaxe para detectar cambios moleculares en tecidos biolóxicos, xerando unha pegada dactilar molecular única do tecido analizado. O obxectivo xeral desta Tese Doutoral é avaliar o potencial da espectroscopía Raman como técnica de diagnóstico de OA, identificando biomardores ópticos nun modelo ex vivo de cartilaxe articular humano. Para isto, obtivéronse os espectros Raman de explantes de cartilaxe humano procedente de cadeira ou nocello en fresco, cun láser de lonxitude de onda (λ) de 785 nm, 50 mW, 120 acumulacións e resolución 4 cm-1. Baseándose nos cocientes das principais sinais dos espectros obtidos, constituíuse unha proposta de perfil biomarcador, do que se analizaron cuantitativamente os diferentes parámetros tomando como referencia o grao radiolóxico de Kellgren-Lawrence (K-L), o Sistema de Graduación Histolóxico-Histoquímico de Mankin (MS) e a cuantificación bioquímica de glucosaminoglicanos (GAGs) sulfatados e coláxeno. Como resultado, obtívose un conxunto de parámetros Raman que están directamente relacionados con eventos que ocorren a nivel molecular durante a OA, dos que se seleccionaron SGAGs (GAGs sulfatados), ColD/F (Coláxeno defectivo/funcional) e GMF (Grao de mineralización por fosfato) para constituir modelos predictivos da severidade desta enfermidade. Estes parámetros seleccionados permitiron a diferenciación de 2 perfiles nas mostras analizadas: un perfil de “baixa severidade” (K-L 0-II e MS 0-8) e outro de “elevada severidade” (K-L III-IV e MS 9-13). Os modelos predictivos constituidos, tomando como variables resposta tanto o grao K-L como o MS, foron bos, obtendo valores de área baixo a curva (AUC) superiores a 0,8. Como conclusión xeral, demostrouse que a ER permite diferenciar distintos graos de severidade de OA, mediante o estudo de ratios de sinais da pegada molecular da cartilaxe. Confírmase desta forma o seu potencial como ferramenta diagnóstica complementaria da OA.[Abstract] Osteoarthritis (OA) is the most common rheumatic disease, characterized by progressive articular cartilage degradation, subchondral sclerosis and inflammation of the synovial membrane. On its early stages, OA is asymptomatic and its current gold-standard diagnosis (X-Rays) mainly evaluates changes in the cartilage adjacent tissue, the bone, limiting the diagnosis to moderate or advanced stages of the disease. Raman spectroscopy (RS) has been recently described as a label-free, non-destructive tool to detect molecular changes in biological tissues, producing a unique fingerprint. The main objective of this Doctoral Thesis is to evaluate Raman Spectroscopy potential as a diagnostic technique, through the identification of optical biomarkers in an ex vivo model of human articular cartilage. To achieve this, Raman spectra of fresh human cartilage explants from hip or knee were obtained, with a NIR laser of wavelength (λ) 785 nm, 50 mW, 120 scans, and a resolution of 4 cm-1. A biomarker profile was proposed based on ratios of the main spectral signals obtained, which were later quantitatively analyzed using as reference the Kellgren-Lawrence (K-L) radiological grade, the Mankin Histological-Histochemical Graduation System (MS) and the biochemical quantification of sulphated glycosaminoglycans (GAGs) and collagen. As a result, a set of Raman parameters that are directly related to events that occur at the molecular level during OA were obtained, from which SGAGs (sulphated GAGs) ColD/F (Defective/functional collagen) and GMF (Phosphate mineralization grade) were selected in order to constitute predictive models of OA severity. Selected parameters allowed the differentiation of 2 profiles in the analysed samples: a “low severity” profile (K-L 0-II y MS 0-8) and another one of “high severity” (K-L III-IV y MS 9-13). The constituted predictive models, taking both K-L grade and MS as response variable, were considered good models, obtaining values of the area under curve (AUC) values greater than 0.8. As a general conclusion, RS allowed the differentiation of OA severity grades, by analysing signals ratios of cartilage molecular fingerprint. This fact confirms its potential as a complementary diagnostic tool for OA