Określenie profilów ekspresji ludzkich genów Elp4, 5 i 6 oraz ich wklonowanie do wektora ekspresyjnego pETM30

Cząsteczki tRNA są jednym z podstawowych elementów mechanizmu translacji białka. Aby regulować rygorystyczny proces translacji, konieczne są modyfikacje tRNA, aby utrzymać jego strukturę drugorzędową i, co ważniejsze, przyczynić się do parowania zasad między tRNA i mRNA w rybosomie. Jedna z najbardziej istotnych modyfikacji tRNA wpływa na pozycję wobble U_34 w pętli antykodonowej. Kompleks białkowy Elongatora (Elp) katalizuje modyfikację chemiczną na U_34 , aby wygenerować 〖cm〗^5 U_34 , które może być dalej modyfikowane do różnych produktów końcowych. Stwierdzono, że rozregulowanie Elp, takie jak nadekspresja lub utrata funkcji, wiąże się z początkiem nowotworów lub chorób neurodegeneracyjnych. Elp jest wysoce konserwatywny od organizmów drożdżowych po organizmy ludzkie i składa się z dwóch kompleksów, mianowicie Elp123 i Elp456. Elp123 zawiera aktywność katalityczną modyfikacji, natomiast Elp456 niesie aktywność ATPazy. Strukturę Elp i charakterystykę biochemiczną przedstawiono niedawno, ale badania te przeprowadzono dla Elp drożdżowego, natomiast struktury krystaliczne podjednostki Elp 3 uzyskano z bakterii i archeonów. Biochemiczna charakterystyka ludzkiego Elp nie została jeszcze wyjaśniona. W tej pracy magisterskiej zrobiono pierwszy krok w badaniu ludzkiego Elp456 w odniesieniu do profili ekspresji jego izoform w różnych ludzkich liniach komórkowych. Wyniki wykazały, że wzory ekspresji izoform nie były jednakowe w różnych typach komórek. Ponadto wybrano jeden spośród hElp4, hElp5 i hElp6 do ekspresji rekombinowanego białka w bakteryjnym lub owadzim systemie ekspresyjnym. Obecnie hElp4v1 został z powodzeniem sklonowany do wektora ekspresyjnego E. coli.tRNA is one essential element of the protein translation mechanism. To regulate protein translation process, modifications of tRNAs are required to maintain its secondary structure and, more importantly, contribute to the base pairing between tRNA and mRNA in the ribosome. One of the most crucial tRNA modification affects the wobble position 〖( U〗_34) at the anticodon stem-loop. The Elongator protein complex (Elp) catalyzes the chemical modification on 〖(U〗_34), to generate the cm^5 U_34, which can be further modified to different end products. The dysregulation of Elp, such as overexpression or loss of function, have found to be related to the onset of cancers or neurodegenerative diseases. Elp is highly conserved from yeast to human and consists of two sub-complexes, namely Elp123 and Elp456. Elp123 contains the catalytic modification activity while Elp456 harbors ATPase activity. The Elp structure and biochemical characterizations were presented recently. Still, all were performed in the yeast system, whereas crystal structures of the Elp subunit three were obtained from bacteria and archaea. The biochemical characterization of human Elp is yet to be clarified. In this master thesis, we took the first step in investigating human Elp456 regarding their isoform expression profiles in different human cell lines. The results revealed that isoform expression patterns were not universal in different cell types. Furthermore, we have chosen variant one from hElp4, hElp5, and hElp6 for recombinant protein expression in either the bacterial expression system or insect cell expression system. Currently, hElp4v1 has been successfully cloned into the E. coli expression vector