Analysis of the effect of camptothecin on the localization of lncRNA NORAD in HeLa cell line

NORAD jest nowo zidentyfikowanym długim niekodującym RNA (lncRNA) aktywowanym przez uszkodzenia DNA. Wykazano, że NORAD jest niezbędny dla utrzymania stabilności genomu i naprawy DNA w ludzkich komórkach. Najnowsze doniesienia sugerują, że NORAD może wykorzystywać unikalny mechanizm do regulacji funkcji białek, jednak opublikowane próby wyjaśnienia jak funkcjonuje NORAD są ze sobą sprzeczne. Celem niniejszej pracy było zweryfikowanie dwóch negujących się wyników badań, na temat tego czy NORAD ulega translokacji do jądra komórkowego pod wpływem powstania dwuniciowych pęknięć DNA (DSB). W obu opublikowanych pracach do badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji NORAD wykorzystywano fluorescencyjną hybrydyzację in situ (smRNA FISH), a przyczyną rozbieżnych wyników prawdopodobnie był różny zestaw sond używanych przez autorów tych publikacji. W mojej pracy wykorzystano nowo zaprojektowany zestaw sond do smRNA FISH pozwalający na wykrywanie pojedynczych cząsteczek lncRNA NORAD. Jako modelowy induktor DSB wykorzystano kamptotecynę – związek chemiczny hamujący eukariotyczną topoizomerazę I i prowadzący do powstawania DSB. W przedstawionych badaniach komórki nowotworowe HeLa zostały poddane 18-godzinnej inkubacji z kamptotecyną. Następnie komórki zostały utrwalone, a cząsteczki NORAD wybarwiono za pomocą techniki smRNA FISH. Analiza uzyskanych preparatów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pozwoliła na obliczenie całkowitej liczby cząsteczek NORAD w pojedynczych komórkach oraz na wyznaczenie ilości NORAD w obszarze jądra komórkowego oraz cytoplazmy dla komórek kontrolnych oraz komórek inkubowanych z kamptotecyną. Potwierdzono brak translokacji cząsteczek NORAD do jądra komórkowego po 18-godzinnej inkubacji komórek HeLa z kamptotecyną.NORAD is a newly identified long non-coding RNA (lncRNA) activated by DNA damage. NORAD has been shown to be essential for maintaining genome stability and DNA repair in human cells. Recent reports suggest that NORAD may use a unique mechanism to regulate protein function, but published results of attempts to explain how NORAD works are contradictory. The aim of this study was to verify, which of the two research results is credible: the one indicating- or the one negating NORAD translocation into the cell nucleus in response to the formation of double-stranded DNA breaks (DSB). In both published reports fluorescence in situ hybridization (smRNA FISH) was used to study the intracellular location of NORAD, and the reason for the divergent results was probably the different set of probes used by the authors. In my work a newly designed set of smRNA FISH probes was used, which allows the detection of individual NORAD lncRNA molecules. Camptothecin, a compound, which inhibits eukaryotic topoisomerase I and leads to DSB, was used as a model DSB inducer. In this work, HeLa cells were incubated for 18 hours with camptothecin. The cells were then fixed and NORAD molecules were stained with smRNA FISH probes. Fluorescence microscopy allowed the counting of the total number of NORAD molecules in individual cells and the determination of the amount of NORAD in the area of the cell nucleus and cytoplasm for the control cells and cells incubated with camptothecin. The lack of translocation of NORAD molecules into the nucleus after 18 hours of incubation of HeLa cells with camptothecin was confirmed