Changes in the exoproteome of Staphylococcus aureus after deletion of mazEF

Badania zmian w peptydomie Staphylococcus aureus po usunięciu systemu toksyna-antytoksyna mazEF.Staphylococcus aureus jest poważnym ludzkim patogenem bakteryjnym jak i wszechobecnym gram-dodatnim gronkowcem, kolonizującym około jednej trzeciej światowej populacji ludzi. Ponadto różne szczepy Staphylococcus aureus produkują także kilka toksyn, które przyczyniają się do ich patogenności. Systemy toksyna – antytoksyna kontrolują mechanizmy, które w dużej mierze przyczyniają się do niepowodzenia obecnych antybiotyków. Rola fizjologiczna bakteryjnych układów TA pozostaje nieznana. U S. aureus fenotyp i rola fizjologiczna systemu mazEF też pozostają niejasne. System chromosomalnego mazEF koduje toksynę RNazy MazF i MazE antytoksyny i jest jednym z najbardziej intensywnie badanych systemów TA . Użycie barwników fluorescencyjnych w elektroforezie dwukierunkowej (dwukierunkowa elektroforeza różnicowa 2D-DIGE) jest powszechnie stosowaną strategią badawczą w analizach proteomicznych. Ale podczas analizy peptydomu zewnątrzwydzielniczego gronkowców niektóre małe białka i peptydy umykają w trakcie analizy tą metodą. Celem pracy było sprawdzenie czy są zmiany w peptydomie zewnątrzwydzielniczym dwóch szczepów S. aureus RN4220: typu dzikiego oraz szczepu po usunięciu systemu toksyna - antytoksyna mazEF. Wcześniejsze badania transkryptomu wykazały, że różnicowej ekspresji ulegają między innymi geny toksyny δ. W naszych badaniach zdecydowano wykorzystać metodę HPLC (high-pressure liquid chromatography) ze względu na możliwość identyfikacji ilościowego oznaczania małych peptydów, co pozwoliłoby na weryfikację wyników z transkryptomiki na poziomie peptydomu.Na poziomie fizjologicznym usunięcie mazEF nie skutkowało zatrzymaniu wzrostu. Przeprowadzając charakterystyke porównawczą otrzymanych wyników z HPLC, zauważono, że średnio pik peptydowy odpowiadający delta-hemolizynie w przypadku analizy na kolumnie C4 100 Å jest mniejszy u mutantów. Na kolumnie C8 300 Å większych zmian zauważono nie było. Pik peptydowy pojawiający się na 34 minucie jest większy dla próbek kontrolnych, niż dla badanych. Należałoby zebrać i zsekwencjonować te frakcje dla upewnienia się, czy odpowiada ten pik delta – hemolizynie.Cele postawione na początku pracy zostały częściowo uzyskane. Zakładano otrzymać większe różnice w proteomach podczas analizy osadu bakteryjnego (pellet) oraz biofilmu zdrapanego z podłoża hodowlanego.Changes in the exoproteome of Staphylococcus aureus after deletion of mazEF. Staphylococcus aureus is a serious human bacterial pathogen. Its increasing antibiotic resistance presents a major clinical challenge, driving intense research into the physiology of the bacterium. Various strains of Staphylococcus aureus also prossess several toxins that contribute to their pathogenicity. Toxin-antitoxin (TA) systems are small genetic elements found in the majority of prokaryotes. TA systems are present also in S. aureus, but were originally identified through their role in plasmid maintenance in other bacteria. MazEF is the most well - known TA system, where MazF is a stable toxin that cleaves specific mRNA, and MazE is an unstable antitoxin that inhibits MazF.The aim of this study was to check if there are some changes in the exoproteome between the wild type of S.aureus and S.aureus after deletion of the toxin-antitoxin system mazEF. We used HPLC (high-pressure liquid chromatography) to identify changes in the exoproteome. The difference between strains RN4220 wild type and RN4220 ΔmazEF was only in the peptide peak corresponding to delta-hemolysin. Delta hemolysin or toxin is a 26 amino acid peptide. It is produced and lyses erythrocytes, a variety of mammalian cells and sub - cellular structures such as membrane bound organelles, spheroplasts and protoplasts by 97% of S. aureus isolates.Performing a comparative characterization of the results obtained using HPLC on a C4 100Å column, it was noted that, on average, the peptide peak corresponding to delta hemolysin is less in the mutants than in the wild type of S.aureus. No further major changes were observed on the C8 300Å column. Peptide peaks, appearing in 34 minutes from the beginning of the experiment, were greater for controls than for test samples.These fractions must be collected and sequenced to ensure that this peak corresponds to delta hemolysin. The goals, which were set at the beginning of the work, were partially achieved. It is assumed that larger differences in proteomes will be obtained during the analysis of bacterial sludge (pellets) and scraped biofilm from the culture medium