Clonning, production and initial characterization of light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase from pea (Pisum sativum)

Poniższa praca dyplomowa poświęcona jest zależnej od światła oksydoreduktazie protochlorofilidu (LPOR), która jest białkiem katalizującym jedną z końcowych reakcji syntezy chlorofilu. Enzym ten jest interesującym obiektem badań, gdyż jego aktywność jest regulowana światłem, co jest rzadkością wśród poznanych do tej pory biokatalizatorów. Co więcej ten element syntezy chlorofilu nie jest szeroko poznany. W związku z czym praca ta ma na celu pogłębienie wiedzy na temat LPOR występującej w grochu. Przeprowadzone eksperymenty rozpoczęto od sklonowania badanego białka, w celu jego wyprodukowania, po czym je oczyszczono, aby móc przystąpić do ocenienia jego aktywności oraz prowadzonej przez nie reakcji. Do badania katalizowanego procesu użyto substratów enzymu jakimi były: protochlorofilid (Pchlide), NADPH. Oraz do wybranych serii pomiarowych dodano lipid fosfatydyloglicerol. Uzyskane wyniki porównano z dostępnymi w literaturze wynikami uzyskanymi dla izoformy tego białka obecnej w A.thaliana, co pozwoliło na dostrzeżenie pewnych różnic w funkcjonowaniu różnych izoform oksydoreduktazy protochlorofilidu.Clonning, production and initial characterization of light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase from pea (Pisum sativum)This thesis is devoted to light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase (LPOR) which is the protein catalizing one of the final reactions of chlorophyll biosynthesis. This enzyme is an interesting object of studies, because its activity is regulated by light, what is really rare property of biocatalysts which are known nowadays. Moreover this element of chlorophyll biosynthesis is not widely known. Therefore the following thesis aims to increase the knowledge about LPOR present in pea. The experiments started with the cloning of the gene what allowed its heterological production. Then the protein was purified and its activity investigated. Protochlorophyllide (Pchlide) and NADPH were used for testing the reaction, and in some measuring series, also PG was added. The results were compared to results from literature for the isoform from A. thaliana. Some differences in the functioning of different isoforms of protochlorophyllide oxidoreductase were identified