Analysis of MCPIP-1 protein cytrulination by human peptidylarginine deiminase type IV

Białko MCPIP-1 (ang. monocyte chemoattractant protein-1 induced protein-1), nazywane również Regnazą-1, należy do grupy negatywnych regulatorów stanu zapalnego i ma istotne znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania komórek układu odpornościowego. Dzięki aktywności RNazowej oraz poprzez regulację szlaku przekazu sygnału NF-κB kontroluje produkcję czynników prozapalnych, dlatego też modyfikacje potranslacyjne białka MCPIP-1 mogą znacząco wpływać na odpowiedź tych komórek. Dotychczasowe badania pokazują, że białko MCPIP-1 ulega fosforylacji, a następnie ubikwitynacji, prowadzącej do jego degradacji w proteasomie, a ponadto stanowi substrat dla ludzkiej parakaspazy MALT-1. Jednakże nie ma doniesień wskazujących, że podlega procesowi cytrulinacji. Przekształcenie peptydyloargininy do peptydylocytruliny katalizowane jest przez rodzinę zależnych od wapnia deiminaz peptydyloargininowych (PAD, ang. peptidylarginine deiminase). Z uwagi na to, że w cytoplazmie komórek układu odpornościowego wykazano obecność zarówno MCPIP-1 jak i PAD4, dlatego przeprowadzono badania mające na celu weryfikację, czy reszty argininy w sekwencji białka MCPIP-1 podlegają cytrulinacji enzymem PAD4. W tym celu przeprowadzono cytrulinację rekombinowanego białka MCPIP-1 przez ludzki enzym PAD4, a następnie analizowano reakcję przy pomocy sondy specyficznie wiążącej się do reszt cytruliny. Wyniki uzyskane tą metodą wykazały, że białko MCPIP-1 ulega cytrulinacji katalizowanej przez enzym PAD4, co pośrednio potwierdziła również analiza Western blot. Podsumowując, weryfikacja cytrulinacji białka MCPIP-1 przez enzymy PAD w komórkach układu odpornościowego, a także określenie wpływu tej modyfikacji potranslacyjnej na aktywność białka MCPIP-1 mogą mieć w przyszłości istotne znaczenie dla pogłębienia wiedzy dotyczącej rozwoju stanu zapalnego.The MCPIP-1 protein (monocyte chemoattractant protein-1 induced protein-1), also called Regnase-1, belongs to the group of negative regulators of inflammatory response and plays an important role in the functioning of immune cells. Due to the RNase activity and by negative regulation of NF-κB signal pathway, it controls the production of pro-inflammatory factors, thus post-translational modifications of the MCPIP-1 protein can significantly affect the response of these cells. Previous studies show that the MCPIP-1 protein undergoes phosphorylation followed by ubiquitination, leading to its degradation in the proteasome, and it serves as a substrate for human MALT-1 paracaspase. However, there are no reports indicating that MCPIP-1 can be citrullinated. The conversion of peptidylarginine to peptidylcytrullin is catalysed by a family of calcium-dependent peptidylarginine deiminases (PAD, peptidylarginine deiminase). Since, both MCPIP-1 and PAD4 are present in the cytoplasm of the immune cells, therefore verification of deamination of arginine residues in the sequence of MCPIP-1 protein by PAD4 was carried out. For this purpose recombinant MCPIP-1 protein was exposed to human PAD4 enzyme activity and the reaction was assessed using a citrulline-binding probes. The obtained results showed that the MCPIP-1 protein undergoes citrullination catalyzed by the PAD4 enzyme, what was also indirectly confirmed by the results of Western blot analysis.In summary, verification of MCPIP-1 protein citrullination in immune cells by PAD enzymes, as well as determining the effect of this post-translational modification on MCPIP-1 protein activity may be important to extend in the future the knowledge about inflammation development