Study of vinblastine toxicity on vascular endothelial cells using confocal Raman microscopy.

Winblastyna należy do leków przeciwnowotworowych (alkaloidów barwinka różyczkowego) skierowanych przede wszystkim na zahamowanie procesu mitozy poprzez wiązanie się z tubuliną, co wpływa na zahamowanie jej polimeryzacji i powstawanie wrzeciona kariokinetycznego niezbędnego do podziału komórki. W celu dokonania dokładnej oceny jej aktywności na stan komórek śródbłonka naczyniowego wykonano obrazowanie ramanowskie komórek linii HAEC inkubowanych w wybranymi stężeniami winblastyny oraz analizę chemometryczną. Hipotezą badawczą niniejszej pracy jest obecność markerów spektroskopowych świadczących o toksycznym działaniu winblastyny na śródbłonek naczyniowy.Niehierarchiczną analizę skupień, KMC wykorzystano w celu wyekstrahowania widm średnich pochodzących od poszczególnych struktur komórkowych (jądra komórkowego, cytoplazmy oraz siateczki śródplazmatycznej) dla wszystkich badanych grup komórek: kontrolnych oraz inkubowanych z winblastyną o stężeniu 1, 10, 50 nM. Analiza porównawcza uzyskanych widm średnich pozwoliła na zaobserwowanie istotnych zmian biochemicznych. Otóż w wyniku stymulacji komórek winblastyną zauważono: •wzrost zawartości lipidów potwierdzony testami biochemicznymi, co wskazuje na obecność stanu zapalnego i zwiększonej syntezy mediatorów zapalnych (np. eikozanoidów),•spadek sygnału pochodzącego od cytochromu, co wskazuje na uszkodzenie mitochondrium lub utlenienie tej formy hemoproteiny,•wzrost zawartości białek w obszarze cytoplazmatycznym, co wskazuje na mobilizację komórek do tworzenia włókna kariokinetycznego (wzrost zawartości tubuliny), zatrzymanie mitozy,•spadek zawartości kwasów nukleinowych, co może wskazywać na interkalację winblastyny do DNA zawartego w obszarze poza jądrowym lub uszkodzenie oksydacyjne kwasów nukleinowych.Przeprowadzone analizy HCA oraz PCA pozwoliły również na potwierdzenie obecnosci różnic spektralnych między widmami komórek kontrolnych a stymulowanych farmakologicznie. Pozwoliły również na klasyfikację komórek prawidłowych i zmienionych w wyniku inkubacji w winblastyną. Uzyskane wyniki potwierdzają zatem założenia teoretyczne dotyczące klasyfikacji winblastyny do interkalatorów DNA oraz leków wpływających na zahamowanie procesu mitozy.Vinblastine belongs to anti-cancer drugs (alkaloid from Vinca rosea) focused primarily at inhibiting of the mitosis process by binding to tubulin, what inhibits its polymerization and the formation of the karyokinetic spindle, which in turn is necessary for cell division. In order to accurately assess its activity on the condition of vascular endothelial cells, Raman imaging of HAEC line cells incubated with selected concentrations of vinblastine and chemometric analysis was performed. The research hypothesis of this work is the presence of spectroscopic markers exhibiting the toxic effect of vinblastine on vascular endothelium.Non-hierarchical k-means cluster analysis (KMC) was used to extract average spectra from single cell structures/areas (cell nucleus, cytoplasm and endoplasmic reticulum) for all investigated groups of cells: control and incubated with vinblastine at a concentration of 1, 10, 50 nM. A comparative analysis of the obtained average spectra allowed for the observation of significant spectral, and therefore biochemical changes. Based on the obtained results, it was noted:• increase in lipid content confirmed by biochemical tests, which indicates the presence of inflammation and increased synthesis of inflammatory mediators (e.g. eicosanoids),• a decrease in the signal from the cytochrome, which indicates mitochondrial damage or oxidation of this form of hemoprotein,• increase in the content of proteins in the cytoplasmic region, which indicates the mobilization of cells to form karyokinetic spindle (increase in tubulin content), arrest of mitosis,• decrease in the content of nucleic acids, which may indicate the intercalation of vinblastine to DNA contained in the non-nuclear area or oxidative damage of nucleic acids.The analysis conducted by means of HCA and PCA confirmed the presence of the spectral differences between the spectra of control cells and stimulated with vinblastine. Obtained results allowed also for the classification of normal and altered cells as a result of incubation with the drug. The obtained results confirmed the theoretical assumptions regarding the classification of vinblastine into DNA intercalators and drugs that inhibit the mitosis process