Characterization of subclones of the rhabdomyosarcoma cell line to identify genes crucial for tumor progression

Proces powstawania mięśni, czyli miogeneza, podlega regulacji ze strony licznych czynników transkrypcyjnych z rodzin SIX (SIX1/4), PAX (PAX3/7) oraz MRF (m. in. MYF5, MYOD). Zaburzenia procesu różnicowania mogą doprowadzić do powstania mięsaka prążkowanokomórkowego (RMS), który jest najczęściej występującym nowotworem tkanek miękkich u dzieci. Wyodrębnia się kilka podtypów RMS, w tym podtyp zarodkowy (ERMS), stanowiący około 70% wszystkich przypadków RMS oraz podtyp ARMS, zazwyczaj związany ze złymi rokowaniami. Mechanizmy prowadzące do rozwoju RMS są wciąż słabo poznane. W niniejszej pracy przedstawiono badania, mające na celu identyfikację genów istotnych dla progresji RMS. Głównym celem badań było porównywanie dwóch subklonów linii ARMS RH30 pochodzących z różnych źródeł: RH30 PJH (podarowanych przez dr. PJ Houghton’a) oraz RH30 ATCC (zakupionych z ATCC), charakteryzujących się jednakowym profilem STR, jednak różniących się morfologicznie. Wyniki eksperymentów sugerują, że subklony linii RH30 różnią się pomiędzy sobą tempem proliferacji, aktywnością migracyjną, zdolnościami hemotaktycznymi in vitro oraz poziomem ekspresji receptorów CXCR4/7. Analiza qPCR wskazuje na różny poziom ekspresji czynników miogennych, takich jak MYOD, MYOG czy czynniki ID. Stwierdziliśmy również, że komórki RH30 ATCC są PA¬X7 negatywne, natomiast RH30 PJH PAX7+. Stało się to punktem wyjściowym do badań z użyciem siRNA przeciwko PAX7. Otrzymane wyniki wskazują na istotną rolę PAX7 dla przeżywalności, proliferacji i migracji komórek RH30. Badania te są nowatorskie, gdyż rola PAX7 w komórkach ARMS negatywnych pod względem fuzji PAX7-FOXO1 jest słabo poznana. Sprawdzono również poziom ekspresji genów zaangażowanych w miogenezę w kilku innych liniach RMS typu zarodkowego i pęcherzykowego. Rezultaty potwierdzają opisywane w literaturze tendencje i sugerują nieopisywaną wcześniej rolę czynników ID w rozwoju RMS. Podsumowując, opisane w tej pracy wyniki wskazują, że linie nowotworowe o tym samym profilu STR mogą wytworzyć subklony różniące się wieloma cechami, takimi jak proliferacja czy migracja. Stanowią też podstawy do dalszych badań nad rolą białek PAX7 oraz ID w rozwoju RMS, a tym samym mogą przyczynić się do poznania dokładniejszych mechanizmów prowadzących do rozwoju tego nowotworu.Myogenesis is the process of muscle formation and is regulated by a number of transcription factors, included proteins from families: SIX (SIX1/4), PAX (PAX3/7) and MRF (eg. MYF5, MYOD). Disturbances in the differentiation process may lead to rhabdomyosarcoma (RMS), which is the most frequent soft tissue tumor in children. Several RMS subtypes are distinguished, including the embryonic subtype (ERMS), which accounts for approximately 70% of all RMS cases, and the alveolar (ARMS) subtype which is usually associated with poor prognosis. Mechanisms leading to the development of RMS are still poorly understood. This paper presents studies aimed at identifying genes crucial for RMS progression. The main goal of the research was to compare two subclones of the ARMS RH30 cell line with different origin: RH30 PJH (donated by dr. PJ Houghton) and RH30 ATCC (purchased from ATCC). Sublines were characterized by the same STR profile, but different morphology. The results of the experiments suggest that the subclones of the RH30 line have different rate of proliferation, migration activity, chemotactic abilities in vitro, and the level of CXCR4/7 receptors xpression. RT-qPCR analysis indicates a different level of expression of myogenic markers, such as MYOD, MYOG and ID factors. There also was found that RH30 ATCC cells are PAX7 negative, while RH30 PJH are PAX7+ cells. This became the starting point for research assuming usage of siRNA against PAX7. The results obtained indicate the important role of PAX7 for the survival, proliferation and migration of RH30 cells. These studies are innovative because the role of PAX7 in ARMS cells that do not display PAX7-FOXO1 translocation is poorly known. The level of expression of genes involved in myogenesis in several other embryonal and alveolar RMS cell lines was also investigated. The results confirm the tendencies described earlier in the literature and additionally suggest the new role of ID factors in RMS that was not described earlier. In summary, the results described in this paper suggest that cancer cell lines with the same STR profile can produce subclones that differ in many features, such as: the profile of gene expression, proliferation or migration. In addition, they form the basis for further research on the role of PAX7 and ID proteins in the development of RMS, and thus may help in better understanding of mechanisms contributing to progression of this cancer