Identification of clinically relevant Streptococcus and Enterococcus species based on biochemical methods and 16S rRNA, sodA, tuf and rpoB genes sequencing

Bakterie z rodzajów Streptococcus i Enterococcus mają duże znaczenie kliniczne i epidemiologiczne, a rutynowa diagnostyka zakażeń nie zawsze pozwala na jednoznaczną identyfikację gatunkową. Rozwój technik biologii molekularnej pozwolił na wprowadzenie szybkiej i wiarygodnej diagnostyki laboratoryjnej. Celem pracy była identyfikacja gatunkowa szczepów z rodzajów Streptococcus i Enterococcus z zastosowaniem metod genetycznych i fenotypowych oraz wyznaczenie najbardziej dyskryminującej metody identyfikacji.Z użyciem metod stosowanych w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej zidentyfikowano 20 izolatów pochodzenia klinicznego, 12 z rodzaju Streptococcus, 5 Enterococcus oraz 3 gatunki nienależące do rodzaju Streptococcus. Stosując metody fenotypowe oznaczono właściwości hemolityczne badanych szczepów, określono serotypy oraz stworzono antybiogramy paciorkowców i enterokoków. W celu precyzyjnej identyfikacji oraz wyznaczenia najbardziej różnicującej metody, zastosowano sekwencjonowanie Sangera genów 16S rRNA, sodA, tuf oraz rpoB. Sekwencjonowanie genu 16S rRNA pozwoliło na identyfikację 16 gatunków paciorkowców (64 %) i 3 gatunków enterokoków (60 %), sodA 9 (36 %) gatunków paciorkowców i 3 (60 %) gatunków enterokoków, tuf 13 (52 %) gatunków paciorkowców i 4 (80 %) gatunków enterokoków, a sekwencjonowanie rpoB pozwoliło na identyfikację 19 (76 %) gatunków paciorkowców i 5 (100 %) gatunków enterokoków, dodatkowo oznaczono 3 gatunki nienależących do rodzaju Streptococcus. Wykorzystano również sekwencjonowanie genu recA, które pozwoliło na identyfikację 4 (80 %) gatunków należących do paciorkowców grupy mitis. Wyniki przeanalizowano z użyciem dwóch publicznie dostępnych baz danych. Badane izolaty wykazywały głownie α-hemolizę i oznaczały się różną antybiotykoopornością.Wyniki wskazują, iż analiza sekwencji genów jest metodą bardziej wiarygodną niż testy fenotypowe, ale konieczne jest zastosowanie innych metod oraz markerów molekularnych. Sekwencjonowanie genów 16S rRNA i sodA charakteryzowało się najniższą siłą dyskryminującą, zaś sekwencjonowanie genu rpoB cechowało się najwyższą siłą dyskryminującą zarówno podczas identyfikacji paciorkowców, jak i enterokoków, co pozwoliło na jednoznaczną identyfikację gatunkową wszystkich izolatów.Streptococcus and Enterococcus bacteria are of great clinical and epidemiological importance, and routine diagnostics of infections does not always allow unequivocal species identification. The development of molecular biology techniques has made it possible to introduce a rapid and reliable diagnostics of the infections caused by these microorganisms. The aim of the study was to identify Streptococcus and Enterococcus species using genetic and phenotypic methods and to determine the most discriminating identification method. Methods used in routine microbiological diagnostics allowed the identification of 20 isolates of clinical origin, 15 of the genus Streptococcus and 5 Enterococcus, 3 non streptococci species have been additionally identified. The hemolytic properties serotype and antimicrobial resistance were determined using phenotypic methods. For precise identification and determination of the most differentiating method, the Sanger sequencing of the 16S rRNA, sodA, tuf and rpoB genes was used. The 16S rRNA gene sequencing allowed the identification of 16 species of streptococci (64%) and 3 species of enterococci (60%), sodA 9 species of streptococci (36%) and 3 species of enterococci (60%), tuf 13 species of streptococci (52%) and 4 species of enterococci (80%), and the sequencing of rpoB allowed the identification of 19 species of streptococci (76%) and 5 species of enterococci (100%), 3 non streptococci species have been additionally labelled. The sequencing of the recA gene was used to identify 4 (80 %) species belonging to streptococci mitis group. The results were analysed using two publicly available databases. The isolates studied showed mainly α-hemolysis and showed different antibiotic resistance. The results obtained indicate that gene sequence analysis is more reliable than phenotypic tests used in routine diagnostic laboratories, but several methods and molecular markers have to be used to confirm species identification results. The sequencing of 16S rRNA and sodA genes had the lowest discriminatory power and the sequencing of rpoB gene was characterized by the highest discriminatory power both for the identification of streptococci and enterococci, which allowed for unambiguous species identification of all isolates