Characterization of inhibition of gingipain R (RgpB) by miropinmut 37, mutant of Tannerella fostythia serpin

Paradontoza jest chorobą przyzębia, z której ostrą postacią boryka się 10-15% dorosłych. Nieleczona może prowadzić nawet do utraty zębów, a jej występowanie zostało skorelowane z ryzykiem wystąpienia i rozwoju takich chorób, jak miażdżyca, choroba Alzheimera, choroba niedokrwienna serca, cukrzyca, reumatoidalne zapalenie stawów, zachłystowe zapalenie płuc, nowotwory. Etiologia paradontozy jest złożona, jednak do kluczowych patogenów zalicza się Porphyromonas gingivalis, której jednym z najważniejszych czynników wirulencji są wydzielnicze proteazy cysteinowe. Kolejny patogen, Tannerella forsythia, kontroluje aktywność „obcych” peptydaz poprzez wydzielanie białkowego inhibitora, miropiny. Jest ona wyjątkowa nie tylko ze względu na rzadkość występowania inhibitorów z rodziny serpin wśród organizmów prokariotycznych, ale przede wszystkim ze względu na całkowicie unikatową dla serpin zdolności hamowania szerokiego zakresu proteaz z użyciem trzech równocennych miejsc aktywnych w obrębie pętli reaktywnej (ang. RCL - reactive center loop). Czyni to z miropiny interesujący przedmiot badań między innymi jako punktu wyjścia dla zaprojektowania mutanta miropiny o szerokim zakresie hamowanych proteaz. Próbę stworzenia takiego mutanta podjęto w Zakładzie Mikrobiologii, gdzie otrzymano mutant miropiny oznaczony numerem 37 (miropinamut 37), który hamuje cztery proteazy wydzielnicze P.gingivalis: Kgp, RgpA, RgpB, Tpr. Celem pracy była dokładna charakterystyka hamowania RgpB przez miropinęmut 37. Przeprowadzona procedura pozwoliła na uzyskanie preparatu miropinymut37 o wysokim stopniu homogenności. Uzyskany mutant hamował RgpB ze stechiometrią inhibicji (SI) równą 1,68±0,08 oraz stałą szybkości asocjacji (kass) wynoszącą 2,19±0,16×105 M-1s-1. Są to obiecujące wyniki w świetle znanych z literatury wartości dla dzikiego wariantu miropiny. Z uwagi na swoją unikatowość wśród białkowych inhibitorów prokariotycznych, przeprowadzone badania miropinymut 37 stanowią pierwszy etap w poszukiwaniu wydajnej serpiny o szerokiej specyficzności dla hamowanych proteaz, który w przyszłości może posłużyć do zaprojektowania skutecznego inhibitora znajdującego zastosowanie w terapii paradontozy. Kolejnym etapem prac powinno być sprawdzenie czy miropinamut 37 hamuje proteazy cysteinowe P. gingivalis bezpośrednio związane z powierzchnią bakterii, a następnie sprawdzenie czy miropinamut 37 obniża wirulencję P. gingivalis w modelu mysim.Periodontitis is a chronic disease of teeth supportive tissues or periodontium affecting 10-15% of adults. If untreated, the disease may lead not only to teeth loss but is also correlated with a higher risk of development and/or severity of such diseases as atherosclerosis, cardiovascular disease, Alzheimer disease, diabetes mellitus, rheumatoid arthritis and respiratory diseases. Although the aetiology of periodontitis is complex, Porphyromonas gingivalis is perceived to be one of the keystone pathogens, with its secretory cysteine proteases being prominent virulence factors. Another periodontal pathogen, Tannerella forsythia, secretes miropin - a protease inhibitor belonging to the serpin family that controls the activity of proteases secreted by other bacterial species. Miropin is an exceptional serpin due to its ability to inhibit a broad spectrum of proteases using three equivalent active sites within the reactive centre loop (RCL). These properties make miropin an interesting scaffold for generating a multivalent inhibitor of proteases involved in the aetiology of a particular disease such as periodontitis. An effort to design such an inhibitor was made within the Department of Microbiology, where miropin mutant no. 37 (miropinmut 37), that was proved to be able to inhibit four of P. gingivalis secretory proteases (Kgp, RgpA, RgpB, Tpr), was obtained. Therefore, the aim of this study was to characterize details of interaction of miropinmut 37 with gingipain R (RgpB). A homogenous recombinant miropinmut 37 was obtained and then the interaction of miropinmut 37 with RgpB was characterized by determination of stoichiometry of inhibition (SI) and association rate constant (kass). Miropinmut 37 inhibited RgpB with SI of 1,68±0,08 and kass equal to 2,19±0,16×105 M-1s-1. The determined efficiency of inhibition of RgpB by the mutant was similar to inhibition of target proteases by wild-type miropin. Based on the literature, the obtained results suggest that the miropinmut 37 can efficiently inhibit target proteases. The conducted experiments were the first step in research aiming for using miropin as a scaffold to develop a potent multivalent protease inhibitor, which may be applied in the treatment of diseases such as periodontitis, in which aetiology proteolytic enzymes play the crucial role. Subsequent steps should include checking whether miropinmut 37 inhibits cysteine proteases on the surface of P. gingivalis, and then verification if the miropin mutant reduces P. gingivalis virulence in mice model