Role of microRNA-146a in Duchenne muscular dystrophy progression in mice

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) jest chorobą genetyczną prowadzącą do utraty funkcji mięśni szkieletowych, oddechowych oraz mięśnia sercowego. Spowodowana mutacją w genie dystrofiny i w konsekwencji, brakiem funkcjonalnego białka, nieuchronnie prowadzi do przedwczesnej śmierci. Mimo dobrze poznanych przyczyn, przeprowadzone dotychczas próby terapii genowej nie powiodły się. Obecne metody leczenia skupiają się więc, między innymi, na złagodzeniu stanu zapalnego mięśni, który wraz ze zjawiskami obumierania włókien mięśniowych, zaburzeniami regeneracji oraz zwłóknienia tkanki rozpatruje się jako nieodłączny element patofizjologii DMD. MikroRNA (miRNA) są endogennymi, krótkimi, niekodującymi cząsteczkami RNA odgrywającymi rolę w potranskrypcyjnej regulacji genów. Wpływają one na niemal każdy proces komórkowy. Jak pokazały nasze najnowsze badania, mięśnie dystroficzne wykazują znacząco zwiększoną ekspresję miR-146a. Cząsteczka ta bezpośrednio reguluje białko Numb, będące inhibitorem ścieżki przekazu sygnału Notch, która reguluje proliferację i różnicowanie komórek satelitarnych (mSC, ang. muscle satellite cells), stanowiących pulę komórek macierzystych mięśni odpowiadających za regenerację. W modelach komórkowych, zwiększona ekspresja miR-146a wiąże się z inhibicją różnicowania mioblastów. Co więcej, dane literaturowe wskazują na istotną rolę miR-146a w regulacji odpowiedzi zapalnej, jak również zwłóknienia mięśni. W związku z tym, celem przeprowadzonych badań było zbadanie roli miR-146a w rozwoju zaburzeń u myszy dystroficznych mdx, pozbawionych funkcjonalnego białka dystrofiny. Analizy przeprowadzono na materiale zwierzęcym pobranym z czterech genotypów myszy: dzikich (wt/wt), z wyłączoną ekspresją miR-146a (miR-146a KO), myszy mdx oraz myszy dystroficznych pozbawionych ekspresji miR-146a (dKO). Poprawność genotypów potwierdzono analizując ilość transkryptu miR-146a oraz obecność dystrofiny w mięśniu brzuchatym łydki zwierząt. Pod kątem degeneracji włókien mięśniowych nie zauważono zmian wywołanych brakiem ekspresji miR-146a u zwierząt dystroficznych. Dodatkowo, myszy dKO nie wykazały zmian w poziomie nacieku zapalnego oraz ilości tkanki włóknistej w mięśniach szkieletowych w porównaniu z myszami mdx. W kontekście regeneracji, zauważono osłabioną proliferację i różnicowanie aktywowanych mSC dKO w porównaniu z mdx. Efekt ten wydaje się być niezależny od proponowanego mechanizmu, w którym miR-146a wpływa na Numb. Dodatkowo, obniżona ekspresja embrionalnego ciężkiego łańcucha miozyny i miogeniny, oraz zwiększenie ilości transkryptu miR-206 w mięśniach myszy dKO w odniesieniu do mdx, sugerują istnienie mechanizmów kompensacyjnych, które ostatecznie nie pozwoliły na zaobserwowanie różnic w regeneracji wywołanych brakiem miR-146a w mięśniach dystroficznych. Podsumowując, przeprowadzone badania sugerują, że miR-146a nie odgrywa istotnej roli w regulacji procesu degeneracji, stanu zapalnego, regeneracji oraz zwłóknienia mięśni dystroficznych.Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a genetic disorder which results in failure of skeletal, respiratory and heart muscles function. Caused by mutations in dystrophin gene and consequent loss of functional protein, DMD inevitably leads to premature death. Despite well-known genetic background, gene therapy trials carried out so far have not been successful. Current treatment focuses on mitigation of muscle inflammation, which, amongst other processes like myofibers degeneration, regeneration failure or muscle fibrosis is an inherent element of DMD pathophysiology. MicroRNAs (miRNA) are a group of small, noncoding RNAs with a role in gene expression regulation at post-transcriptional level. These molecules have the ability to control almost every cellular process. Our recent work shows that expression of miR-146a in dystrophic muscles is significantly elevated. MiR-146a directly regulates Numb protein - an inhibitor of Notch signaling pathway, which regulates muscle satellite cells (mSC, muscle stem cells) proliferation and differentiation. In cellular models, enhanced expression of miR-146a results in inhibition of myoblast differentiation. Moreover, as previously shown, this miRNA is an important regulator of inflammation as well as fibrosis. Therefore, the aim of this study was to check the role of miR-146a in progression of the disease in dystrophic mdx mice. Analysis was performed on material collected from four mice genotypes: wild type (wt/wt), miR-146a knock-out (miR-146a KO), mdx animals and dystrophic mice lacking miR-146a expression (double knock-out, dKO). Animals genotype was confirmed via quantitive analysis of miR-146a transcript and dystrophin presence in Gastrocnemius muscle. Analysis of muscle degeneration showed no significant differences upon miR-146a loss in dystrophic mice. Moreover, dKO mice show significant changes neither in the inflammatory cells infiltration in muscles, nor in the amount of fibrotic tissue, as compared to mdx. For regeneration analysis, weakened proliferation and differentiation of activated mSC seems to be independent of previously proposed interaction with Numb transcript. Moreover, downregulation of embryonic myosin heavy chain and myogenin expression combined with overexpression of miR-206 in dKO muscles in comparison with mdx suggests existence of compensatory mechanisms, which, in the end, did not allow to observe differences in muscle regeneration between dKO and mdx mice.To sum up, conducted studies showed lack of role of miR-146a in the regulation of degeneration, inflammation, regeneration and fibrosis of dystrophic muscle