Purification and preliminary biochemical characteristics of Porphyromonas gingivalis proteins SigP and PG1660

Bakteria Porphyromonas gingivalis uważana jest za głównego patogena powodującego paradontozę. Wraz z innymi bakteriami należącymi do typu Bacteroidetes, posiada system sekrecji typu IX (ang. Type 9 Secretion System, T9SS). System ten odpowiada za sekrecję wielu kluczowych czynników wirulencji P. gingivalis, takich jak gingipainy czy deiminaza peptydyloargininowa (PPAD). T9SS jest regulowany przez system dwuskładnikowy (ang. two-component system, TCS) PorXY oraz czynniki o funkcji zewnątrzcytoplazmatycznej sigma (ang. extracytoplasmic function sigma factor, ECF). Występujący w tym systemie TCS regulator odpowiedzi PorX jest jednak nietypowy, gdyż wpływa na regulację ekspresji genów w sposób pośredni, poprzez oddziaływanie z jednym z czynników sigma ECF, SigP. Stosunkowo niedawno odkryto, że mutant delecyjny innego czynnika ECF P. gingivalis, PG1660, wykazuje obniżoną ekspresję genów kodujących niektóre składniki T9SS. Ponadto, PG1660 posiada znaczną homologię sekwencji do białka SigP. Wobec powyższego, postawiono hipotezę, że PG1660 działa podobnie jak SigP i reguluje ekspresję genów T9SS poprzez oddziaływanie z PorX.Niniejsza praca poświęcona jest optymalizacji produkcji i oczyszczania czynników sigma ECF SigP i PG1660 oraz ich wstępnej biochemicznej charakterystyce. Do wklonowania genów sigP lub pg1660 wykorzystano plazmidy pCri, a do produkcji obu białek wykorzystano szczep E. coli Rosetta (DE3). Białka oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa i sączenia molekularnego. Ponieważ literatura podaje, iż ekspresja genu pg1660 wzrasta w warunkach stresu oksydacyjnego, za pomocą analizy western blotting sprawdzono wpływ nadtlenku wodoru na produkcję białek PorX i PG1660. Stres oksydacyjny wydaje się jednak nie wpływać na produkcję obu białek. W pracy przedstawiono również schemat postępowania prowadzący do stworzenia mutantów delecyjnych ΔsigP i Δpg1660, które posłużą do sprawdzenia profilu ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Kolejnym z założeń pracy było zbadanie, czy podobnie jak białko SigP, PG1660 oddziałuje z regulatorem odpowiedzi PorX. W tym celu wykorzystano rozdział elektroforetyczny w warunkach natywnych, procedurę pull-down oraz sączenie molekularne. Uzyskane wyniki sugerują, iż kompleks PorX-PG1660 powstaje, natomiast mechanizm tego oddziaływania wymaga dalszych badań.Porphyromonas gingivalis is considered as the main pathogen that leads to periodontal disease. Like other bacteria from Bacteroidetes, P. gingivalis possesses the Type 9 Secretion System (T9SS). T9SS is responsible for secretion of the virulence factors of P. gingivalis, like gingipains or peptidylarginine deiminase (PPAD). T9SS is regulated by the two-component system (TCS) PorXY and extracytoplasmic function sigma factors (ECF). PorX is the response regulator (RR) of this TCS which affects regulation of gene expression indirectly by interaction with one of the ECF, SigP. It was recently discovered that gene deletion mutant of other ECF, namely PG1660, exhibits reduced expression of some of the genes involved in T9SS. Moreover, PG1660 shows a significant sequence homology to SigP. Therefore, it was hypothesized that PG1660 acts like SigP and regulates expression of the T9SS genes through interaction with PorX.This work is focused on optimization of the production and purification of ECF SigP and PG1660 and on their preliminary biochemical characteristics. The pCri System was used for molecular cloning and E .coli Rosetta (DE3) was used as a host expression strain. The proteins were purified by affinity chromatography and gel filtration chromatography. According to the literature, expression level of pg1660 gene increases during oxidative stress. Therefore, the potential impact of oxidation stress induced by hydrogen peroxide on the production of the proteins was examined. Based on the results, it seems that oxidation stress does not affect the production of both proteins. The work presents also the procedures leading to construction of gene deletion mutants ΔsigP and Δpg1660, which will be later used for gene expression profiling. One of the main purpose of the work was study on the possible interaction between PorX and PG1660. For this purpose native electrophoresis, pull-down procedure and gel filtration chromatography were performed. Obtained results suggest that the complex PorX-PG1660 is formed, however mechanism of the interaction requires further research