Study of the influence of precursors and elicitors on selected secondary metabolites accumulation in Melittis melissophyllum L. shoot cultures

Celem pracy było zbadanie wpływu suplementacji elicytorami (jasmonianem metylu, etefonem), prekursorami (L-leucyną, L-fenyloalaniną, geraniolem) oraz zwiększonej zawartości sacharozy na akumulację kwasów fenolowych i flawonodiów w 23- i 29- dniowym cyklu hodowlanym wytrząsanych kultur pędowych Melittis melissophyllum. Zastosowano podłoże płynne wg Murashige'a i Skoog (MS) uzupelnione : BAP - 1mg/l, NAA - 0,5 mg/l, GA3 - 0,25 mg/l. Hodowlę prowadzono przez 14 dni. Następnie do wszystkich kolb dodano po 100 ml świeżej pożywki. W 18 z 72 kolb hodowlanych świeża pożywka zawierała podwojoną ilość sacharozy. Po kolejnych 7 dniach przeprowadzono suplementację prekursorami i/lub elicytorami. Wariant bez suplementacji traktowano jako hodowlę kontrolną. Biomasę zbierano po 2 i 8 dniach od suplementacji. Przeprowadzono jakościową i ilościową analizę DAD-HPLC kwasów fenolowych flawonoidów w metanolowych ekstraktach z wysuszonej biomasy. Stwierdzono obecność czterech kwasów fenolowych : protokatechowego, chlorogenowego, p-hydroksybenzoesowego, p-kumarowego. W badanych wyciągach obecne były również flawonoidy : cynarozyd, rutozyd, mirycetyna, kwercytryna, kwercetyna, luteolina, kemferol, apigenina, remnetyna.Kultury in vitro Melittis melissophyllum L. zawierają większe ilości kwasów fenolowych i flawonoidów niż roślina gruntowa (np. kwas p-hydroksybenzoesowy 13-krotnie więcej, kwercetyna 18-krotnie więcej). Zastosowanie różnych suplementacji prekursorami i elicytorami pozwala na zwiększenie akumulacji poszczególnych substancji. Kultury in vitro Melisstis melissophyllum L. mogą potencjalnie stanowić biotechnologiczne źródło metabolitów wtórnych.The aim of the study was to determine the effect of elicitors (methyl jasmonate, etephon), precursors (L-leucin, L-phenylalanine, geraniol) and increased amount of sucrose on accumulation of phenolic acids and flavonoids in 23- and 29-day culture cycle in agitated Melittis melissophyllum L. shoot culture. During the experiment liquid MS medium was used with an addition of plant growth regulators : BAP - 1mg/l, NAA - 0,5 mg/l, GA3 - 0,25 mg/l. Culture was carried out for 14 days. After that time 100 ml of fresh MS medium was added to each flask. In 18 out of 72 flasks fresh medium contained double amount of sucrose. After next 7 days precursors and elicitors were added to the medium. Biomass was collected after 2 and 7 days after the addition of elicitors and precursors.High-performance liquid chromatography DAD-HPLC was used to performe qualitative and quantitative analysis of investigated methanol extracts. Four phenolic acids were discovered in the samples : protocatechuic, chorogenic, p-hydroxybenzoic, p-coumaric. The following favonoids were also discovered : cinaroside, rutoside, myricetin, quercetin, quercitrin, luteolin, kaempherol, apigenin, rhamnetin.In vitro cultures of Melittis melissophyllum L. contain bigger amounts of phenolic acids and flavonoids than a wild plant (p-hydroxybenzoic acid 13-times more, quercetin 18-times more). Furthermore, using precursors and elicitors enables even bigger accumulation of selected compounds. In vitro cultures of Melittis melissophullm L. are a potential biotechnological source of secondary metabolites