Optimization of methods assesing an impact of hypoxia and three-dimensional cell culture on osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro

Komórki macierzyste miazgi zęba (ang. dental pulp stem cells – DPSCs) są to komórki pochodzenia ektodermalnego o zdolności do różnicowania w komórki wielu linii. Ich szeroki potencjał do różnicowania wynika z faktu, iż w toku rozwoju embrionalnego powstają one z komórek grzebienia nerwowego – struktury posiadającej bardzo dużą plastyczność. Z grzebienia nerwowego powstają nie tylko kojarzone z ektodermą tkanki takie jak neurony, komórki Schwanna czy melanocyty ale też chrząstka oraz większość kości czaszki. Sprawia to, że komórki macierzyste miazgi zęba jako pochodne grzebienia nerwowego stanowią atrakcyjny materiał biologiczny do badań nad regeneracją uszkodzonych kości – ze szczególnym uwzględnieniem kości czaszki. Bardzo istotnym czynnikiem związanym z właściwościami komórek macierzystych jest wpływ niszy komórkowej, na który składają się zarówno architektura przestrzenna środowiska komórek jak i ogół oddziaływań biochemicznych, którym poddawane są komórki. Doskonałym modelem do badania wpływu niszy na komórki macierzyste jest zastosowanie trójwymiarowych hydrożeli. Innym niezwykle istotnym składnikiem niszy komórkowej jest dostępność tlenu. W przypadku wielu typów komórek macierzystych w ich niszach panują warunki hipoksji rzędu 2-9% stężenia tlenu. Celem pracy było zoptymalizowanie układu doświadczalnego do badania wpływu niszy komórkowej na proces osteogennego różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba poprzez badanie wpływu formy hodowli in vitro w warunkach dwuwymiarowych (2D) lub trójwymiarowych (3D), a także w stężeniu tlenu: 21% lub 2%. W ramach przeprowadzonej pracy przeprowadzono spektrofotometryczny pomiar proliferacji oraz stężenia ATP w hodowli komórek miazgi zęba prowadzonej w warunkach 2D oraz 3D oraz przy stężeniu tlenu 21% oraz 2%. Kolejnym etapem było przeprowadzenie procesu różnicowania komórek miazgi zęba w układzie powyższych warunków. Stopień zróżnicowania DPSCs oceniono poprzez analizę ekspresji genów związanych z procesem osteogenezy (Rux2, Osteopontyna oraz Kolagen 1 A1), a także ocenę stopnia mineralizacji w dniach 7, 14 i 21. Wykazano, iż tempo proliferacji oraz aktywność metaboliczna (stężenie ATP) w hodowli komórek w hydrożelu jest znacząco niższe niż w hodowli dwuwymiarowej. W warunkach hodowli dwuwymiarowej proces różnicowania przebiegał bardziej efektywnie przy stężeniu tlenu 21%. W przypadku hodowli trójwymiarowych nie zaobserwowano znaczących różnic między hodowlą DPSCs w różnych stężeniach tlenu, a różnicowanie osteogenne komórek miazgi zęba obserwowan już po 14 dniach hodowli in vitro.Dental pulp stem cells (DPSCs) are ectoderm-derived cells with a wide potential to differentiation. They differentiation capabilities result from the fact that during embryonic development dental pulp stem cells arises from neural crest – a structure with very high plasticity. DPSCs derivatives are not only neurons, Schwan cells or melanocytes but also bone and cartilage. Thus dental pulp stem cells are very promising source of cells for skeletal defects regeneration with particularly to cranial bone defects repair. While considering stem cells properties one of the most important factor is stem cells niche and its impact on cells. Stem cells niche is defined as a three-dimensional architecture of cells environment but also all biochemical interactions occurring within the niche. Hydrogels may be utilized as a great model for mimicking stem cell niche allowing for the cell culture in three-dimensional condition. Another important properties of cell niche is oxygen concentration, which is rather hypoxic for stem cells niche (2-9%).The aim of this study was to optimize experimental system for investigating impact of cell niche for osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Such system included two main factors: cell culture dimension and oxygen level. Two dimensional (2D) and three dimensional (3D) cell cultures were carried out at collagen coated plates and in hydrogel, respectively, while oxygen level was regulated by properties of cell incubator. To analyze cells proliferation an spectrophotometric colorimetric assay based on dehydrogenase activity were carried out. For metabolic activity ATP concentration was assessed by luminescent assay. Dental pulp stem cells osteogenic differentiation was performed using osteogenic differentiation medium and assessed by quantitative polymerase chain reaction (for genes: Runx2, Osteopontin, Collagen 1 A) and microscopic analyze of mineralized matrix deposition. All experiments were carried out for combined factors: 2D or 3D cell culture and oxygen concentration 21% or 2%. Differentiation process were assessed at days 7, 14 and 21. Proliferation was significantly lower during differentiation in three-dimensional cell culture, while comparing with two-dimensional. A similar effect was observed for ATP concentration measurement. No significant differences were observed between 21% and 2% oxygen concentration in cell culture. For two-dimensional cell culture differentiation were the most successive for normoxia condition. For three-dimensional condition no significant impact of oxygen concentration osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells were observed. Cells differentiated in three-dimensional condition revealed successful differentiation already in day 14