The actin cytoskeleton morphology of mouse embryonic fibroblasts grown on hydrogel elastic substrates

Tak jak każda, nawet najdłuższa podróż, zaczyna się od pierwszego kroku, tak każdy żywy organizm znajduje swój początek w tak małej fabryce życia, jaką jest komórka. „Omnis cellula e cellula”- wszelka, żyjąca komórka pochodzi od innej komórki, powiedział wielki, żyjący na przełomie XIX i XX wieku, niemiecki uczony- Rudolf Ludwig Karl Virchow. W ten sposób podjął próbę uświadomienia ludziom nauki, jak wielkie znaczenie ma zgłębianie wiedzy, na temat mikroświata komórkowego. Poznanie bowiem tajemnic i prawideł rządzących tym światem, pomoże nam w zrozumieniu wielu procesów kierujących całym organizmem żywym.W przedstawionej pracy magisterskiej, za cel wzięto dokładną analizę zmian w strukturze oraz morfologii cytoszkieletu aktynowego mysich fibroblastów embrionalnych (MEF 3T3), ze względu na modyfikację własności mechanicznych oraz chemicznych środowiska, w którym się znajdują. Komórki wysiano na szalki, zawierające wcześniej spreparowane, elastyczne podłoża poliakryloamidowe o modułach Younga równych 40 kPa, 19 kPa oraz 8 kPa funkcjonalizowanych surowicą bydlęcą, bądź roztworem fibronektyny o stężeniu 15 µl/ml. Próbką referencyjną były komórki MEF wysiane na podłoże szklane. Po około dwudziestu godzinach inkubacji w 37 °C, komórki zostały utrwalone oraz wybarwione (cytoszkielet aktynowy- falloidyną znakowaną rodaminą B, jądro komórkowe- DAPI). W następnym kroku rozpoczęto obserwację cytoszkieletu komórek, za pomocą mikroskopii, jak również pomiary dotyczące wysokości komórek, przy użyciu mikroskopu ZEISS Axio Observer, z przystawką konfokalną LSM 710.Otrzymane obrazy mikroskopowe poddano analizie, w programach „ImageJ Fiji”, „ZEN” oraz „OriginPro 2017”, w celu uzyskania danych ilościowych oraz jakościowych. Otrzymane wyniki potwierdziły znaczący wpływ mechanicznych, a także chemicznych właściwości podłoża hodowlanego na morfologię cytoszkieletu aktynowego mysich zarodkowych fibroblastów. Wraz ze wzrostem elastyczności substratu komórki te stawały się wyższe, obkurczone, mniej adherentne. Zmianie ulegała również średnia powierzchnia migrujących komórek, która to wraz z malejącą wartością modułu Younga, również zmniejszała się. Zaobserwowano także, iż na podłożach miękkich komórki występują w bardziej zróżnicowanych, odmiennych morfologiach, niż te hodowane na szkle, cechuje je upośledzona zdolność do tworzenia sieci włókien stresowych, jak również kontaktów zogniskowanych, umożliwiających im dobrą przyczepność do podłoża. Badania wykazały również, że funkcjonalizacja substratów elastycznych roztworem fibronektyny zwiększa zdolność komórek MEF do formowania włókien stresowych, a także do rozpłaszczania się i adhezji.Just like every journey, begins with the first step, so every living organism begins in a small factory of life- the cell. „ Omnis cellula e cellula”- any living cell comes from another cell, the great German scientist, Rudolf Ludwig Karl Virchow said, at the turn of 19 th and 20 th century. In this way, he made an attempt to educate people, how important it is to deepen the scholarship about the surrounding of the cell. Knowing the secrets and rules governing this world, will help us to understand many of the processes that control the whole living organism.In the presented MA thesis, a detailed analysis of changes in the structure and morphology of mouse embryo fibroblasts (MEF 3T3), dependent on the modification of mechanical and chemical properties of the environment was made. Cells were plated on Petri dishes containing pre-prepared, flexible polyacrylamide media with Young`s modulus of 40 kPa, 19 kPa and 8 kPa, coated with fetal bovine serum or fibronectin solution (15 µl/ml). The reference sample was MEF cells placed on the glass substrate. After about twenty hours of incubation at 37 °C, the cells were fixed and stained (actin cytoskeleton- rhodamin phalloidin, cell nucleus- DAPI). In the next step , microscope observations were made, as well as measurements using the ZEISS Axio Observer microscope, with the LSM 710 Confocal attachment.The obtained microscopic images were analyzed in „ImageJ Fiji”, „ZEN” and „OriginPro 2017”, to get quantitative and qualitative results. The results confirmed significant influence of mechanical and chemical properties of the cell culture environment, on the actin cytoskeleton of MEF cells. As the substrate elasticity increased, the cells became taller, shrunk and less adherent. The average surface of migrating cell also changed, decreasing together with the value of the Young module. It has also been observed that on soft substrates, cells are more diverse, morphologically different than those cultured on glass. They likewise have an impaired ability to create a network of stress fibers as well as focal adhesions, allowing them to have good traction to the substrate. Our studies have also shown that the functionalization of elastic substrates by fibronectin enhances the ability of MEF cells to form stress fibers, as well as better flattening and adhesion