The employment of a method for KU80 detection to imaging NHEJ at local DNA damage site

Podwójne pęknięcia nici DNA (DSBs) są dla komórek najgroźniejsze. Najczęstszym sposobem naprawy tego typu uszkodzeń jest naprawa poprzez niehomologiczne scalanie końców DNA (NHEJ). Proces ten jest inicjowany przez białko Ku80, które przyłącza się do uszkodzonych końców DNA, niezależnie od sekwencji i pozwala na rekrutację kolejnych białek, biorących udział w naprawie podwójnego pęknięcia. Ku80 chroni też uszkodzone końce przed degradacją lub niepożądanymi wiązaniami. Celem pracy było zbadanie, czy nową, opublikowaną metodę detekcji białka Ku80 można wykorzystać w celu wyznakowania ognisk NHEJ w komórkach linii HeLa, w których wywołano lokalne uszkodzenia DNA za pomocą wiązki lasera. Metoda ta polega na zastosowaniu wstępnej ekstrakcji komórek przed ich utrwalaniem. Jej celem jest usunięcie frakcji białka, która jest słabiej związana ze strukturami wewnątrzkomórkowymi., co pozwala uwidocznić te cząsteczki Ku80, które są silniej związane z DNA. Przeprowadzone doświadczenia wykazały skuteczność zaproponowanej metody w eliminacji większej części całkowitej puli cząsteczek Ku80 obecnej w jądrze komórkowym. Jednakże, komórki z lokalnie wywołanym uszkodzeniem DNA nie zawierały miejsc nagromadzenia Ku80 w miejscach fosforylacji H2AX, będącego markerem podwójnych pęknięć DNA, co świadczy albo o braku naprawy DNA na drodze NHEJ w tych miejscach, albo też wiązanie Ku80 w miejscach uszkodzonego DNA było zbyt słabe i zostało zerwane w trakcie zastosowanej procedury.DNA double-strand breaks (DSBs) are the most dangerous for cells. The most common way to repair this type of damage is non-homologous end joining (NHEJ). This process is initiated by the Ku80 protein, which attaches to the damaged DNA ends, regardless of the sequence, and allows the recruitment of further proteins which participate in repair of DSBs. The Ku80 also protects the damaged ends from degradation or undesired binding.The goal of the study was to investigate whether the new Ku80 detection method could be used to label NHEJ foci in HeLa cells in which local DNA damage had been induced with a laser light.In the method, pre-extraction is required before cell fixation in order to remove protein fraction that is bound to the intracellular structures with lower affinity. This allows to unmask those molecules that are more tightly attached to DNA.The experiments demonstrated that applied method was effective in eliminating a vast majority of the total number of all molecules of Ku80 from a nucleus. However cells with locally induced DNA damage have not shown Ku80 foci in the place of γH2AX foci, what could indicate that there was no NHEJ at DSBs repair site or the bonding of Ku80 was too weak to survive the applied procedure