Synthesis of xanthine derivatives and the evaluation of their activity as MAO-B inhibitors

Opisane w tej pracy badania wpisują się w badania prowadzone w Katedrze Technologii i Biotechnologii Środków Leczniczych nad związkami pochodnymi ksantyn wykazującymi potencjalne działanie wielocelowe: inhibicję monoaminooksydazy B (MAO-B), antagonizm wobec receptorów adenozynowych (zwłaszcza podtyp A2A) oraz działanie przeciwutleniające.W ramach pracy otrzymano nowe pochodne teobrominy zawierające fragment dopaminy lub p-tyraminy w pozycji 8 ksantyny oraz podstawnik alkilowy lub aryloalkilowy w pozycji N1. Synteza obejmowała cztery etapy, w tym procesy takie jak oksydatywne bromowanie teobrominy, N-alkilację, substytucję oraz deprotekcję grup fenolowych. Utworzenie mieszaniny produktów w pierwszym etapie syntezy uniemożliwiło dokładne obliczenie wydajności procesu. Szlak syntezy poddawano próbom modyfikacji i optymalizacji. Otrzymano 13 z 14 zaplanowanych struktur chemicznych. Produkty poddawano analizom instrumentalnym w celu potwierdzenia ich tożsamości i czystości.Związki finalne poddano badaniu farmakologicznemu na aktywność inhibicyjną wobec MAO-B z wykorzystaniem metody fluorymetrycznej i zestawu odczynników Amplex Red®. Wykonano skrining w stężeniu 10 μM w celu odrzuceniu związków wykazujących aktywność poniżej 50% w stosunku do inhibitora referencyjnego. Wszystkie związki wykazały aktywność wyższą, więc oznaczono wartości IC50, które dla badanych związków odpowiadały stężeniom 13,4 - 447 nM.Podjęto badania in silico metodą dokowania molekularnego otrzymanych struktur do struktury enzymu MAO-B (PDB:2V5Z) i receptora adenozynowego A2A (PDB:3EML) przy użyciu modułu Glide oprogramowania Schrödinger Maestro. Wartości funkcji skorującej dla obydwóch celów mieściły się w zakresie około -11,210 do -7,434 dla MAO-B (za wyjątkiem pojedynczego liganda o wyniku -3,857) oraz około -9,144 do -7,637 dla receptora adenozynowego A2A. Oddziaływania białko-ligand odpowiadały aminokwasom wskazanym w literaturze.Wyniki niniejszej pracy wskazują na obiecujące właściwości otrzymanych pochodnych ksantynowych, otrzymane związki zostaną w dalszej kolejności przekazane do badań radioreceptorowych celem określenia ich powinowactwa do wszystkich czterech podtypów receptorów adenozynowych. Ponadto planowane są testy na ich działanie przeciwutleniające oraz testy in vivo.The research described in this thesis is a continuation of research performed in the Department of Technology and Biotechnology of Drugs on xanthine derivatives displaying potential as multi-target agents: monoamine oxidase B (MAO-B) inhibition, adenosine receptor antagonism (especially towards the A2A subtype) as well as antioxidant properties.As part of this thesis novel theobromine derivatives containing a dopamine or p-tyramine fragment at the 8-position and an alkyl or arylalkyl substituent at the N1-position were obtained. The synthesis consisted of a four-step process including oxidative bromination, N-alkylation, substitution and deprotection of phenolic groups. Due to the formation of a mixture of products at the first stage of the synthesis, proper yield calculations were not possible to perform. The synthetic route underwent tweaks and modifications. Out of the 14 planned chemical structures 13 were obtained. The products were evaluated in terms of identity and purity using several analytical methods.The final products were tested in pharmacological assays to determine their inhibitory activity towards MAO-B using the fluorometric method and the Amplex Red® reagent kit. The initial screening assay at a concentration of 10 μM was performed to eliminate compounds showing activity at a level lower than 50% when compared to a reference inhibitor. Each of the evaluated compounds showed higher activity, so their IC50 were evaluated and the concentrations were in the range of 13,4 - 447 nM.Additionally, molecular docking to the MAO-B enzyme (PDB:2V5Z) and A2A adenosine receptor (PDB:3EML) were performed using the Glide feature of the program Schrödinger Maestro. Docking scores were in the ranges of -11,210 to -7,434 for MAO-B (with the exception of one ligand with a score of -3,857) and -9,144 to -7,637 for the A2A receptor, respectively. Protein-ligand interactions were in line with aminoacids described in literature.The results of this thesis hint at promising properties of the obtained xanthine derivatives and the next step will be radioligand binding assays to examine the affinity towards all four adenosine receptor subtypes. Additionally, tests to evaluate antioxidant properties and in vivo studies are also planned