Searching for new genes controlling spermatogenesis based on a model of multiple knockout in mice.

Niepłodność jest poważną chorobą, coraz częściej definiowaną także jako problem społeczny. Ze zjawiskiem tym zmaga się coraz więcej kobiet i mężczyzn. W ponad 50% przypadków przyczyny niepłodności leżą po stronie męskiej. Przyczyny niepłodności mogą być różnorodne i wieloczynnikowe. Jedną z przyczyn może być czynnik genetyczny, szacuje się, że jest on także podłożem części przypadków niepłodności idiopatycznej. Aby określić genetyczne podłoże niepłodności męskiej, niezbędne jest poznanie funkcji genów kontrolujących spermatogenezę. Jednym z najczęściej stosowanych obecnie sposobów na poznanie funkcji genów jest metoda nokautu genowego. Jednakże wyłączenie pojedynczego genu, choć przyczyniło się do poznania funkcji bardzo wielu genów, nie zawsze daje oczekiwane rezultaty. Wiele cech w tym także płodność to cechy wielogenowe, dlatego wyłączenie pojedynczego genu może nie dawać objawów fenotypowych. W takich przypadkach użyteczną jest technika nokautu wielokrotnego, czyli wyłączenia kilku genów u jednego osobnika. W Instytucie Genetyki Człowieka w Getyndze w Niemczech wyprowadzono sześć linii myszy z nokautem u pojedynczego osobnika od jednego do sześciu genów, specyficznie aktywnych w męskich komórkach płciowych. Dzięki wykorzystaniu tego modelu możliwe było zastosowanie techniki transkryptomu do porównania jądrowej ekspresji genów u osobników płodnych z linii z pięciokrotnym nokautem z ekspresją genów w jądrach osobników niepłodnych z linii z sześciokrotnym nokautem. Na podstawie zmiany ekspresji wyznaczono w ten sposób 55 genów-kandydatów, które potencjalnie mogą być zaangażowane w kontrolę męskiej płodności. Jednym z nich jest gen Adam22. W niniejszej pracy wykazano, że transkrypt tego genu w gonadzie męskiej jest wykrywalny techniką qRT-PCR jedynie w komórkach linii płciowej. W reakcji sekwencjonowania odkryto jądrowo specyficzny transkrypt tego genu, pozbawiony 18 nukleotydów w obrębie sekwencji kodującej, co prowadzi do delecji 6 aminokwasów w białku ADAM22. Wykazano także, że białko ADAM22 jest obecne w gonadzie męskiej myszy i że masa tego białka jest mniejsza od masy molekularnej ADAM22 izolowanego z tkanek somatycznych np. mózgu. Analiza cDNA jak i białka wskazuje, że w jądrze może być aktywna specyficzna forma transkryptu tego genu, inna od transkryptów identyfikowanych w komórkach somatycznych.Infertility is a serious disease described also as a social problem. More and more women and men are struggling with this problem. In more than 50% of cases the male factor is responsible for infertility. The causes of infertility can be different and multifactorial. Genetic factor might be one of the reasons of infertility, it is suggested that also this is the underlying cause of some idiopathic infertility cases. To determine the genetic cause of male infertility it is necessary to describe the function of genes controlling spermatogenesis. The most popular technique to discover gene function is genetic knockout. The knockout of a single gene, however successfully used in determination of function of many genes, not always gives the expected results. Numerous traits, including fertility, are polygenic traits, therefore the targeted disruption of a single gene might not result in a specific phenotype. In such a case, the useful strategy is the generation of multiple knockout lines, it is a disruption of several genes in a single animal. At the Institute of Human Genetics in Gottingen, Germany six multiple knockout lines were generated with targeted mutation from one up to six male germ specific genes in a single animal. Using this model researchers compared testicular trascriptome of fertile male from the knockout line with five knocked out genes with that of infertile males from the line with six ablated genes. After this experiment scientists identified 55 genes, with differential expression in both lines, that are a candidates for genes controlling spermatogenesis. One of them was the Adam22 gene. In mouse testis male germ cells specific expression of this gene was demonstrated using the qRT-PCR technique. Using the sequencing reaction a testis specific Adam22 transcript with the deletion of 18 nucleotides within the coding sequence was identified. This shorter transcript encodes for a 6 amino acids shorter ADAM22 protein. In Western blot experiment ADAM22 was identified in testicular protein extract, but the detected product demonstrated lower molecular mass than observed in somatic tissues e.g. brain. Taken together, the cDNA and protein analyses strongly suggest that Adam22 gene has a testis specific transcript, different from transcripts reported in somatic cells