Analysis of the expression level of the genes and proteins of copper transporters in the kidney of the mice with mutation in Atp7b gene - the animal model of Wilson disease.

Miedź jest ważnym mikroelementem, który jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Pierwiastek ten posiada zdolność przyjmowania i oddawania elektronów i dzięki tej właściwości wbudowany jest w centrum aktywne enzymów katalizujących kluczowe reakcje metaboliczne. Jako przykłady należy wymienić tyrozynazę, oksydazę cytochromu c, oksydazę lizylową, czy ceruloplazminę. Enzymy te katalizują procesy takie jak tworzenie pigmentu, oddychanie komórkowe, tworzenie tkanki łącznej, czy prawidłowy metabolizm żelaza. Utrzymanie prawidłowego poziomu miedzi w organizmie jest regulowane poprzez kontrolę jej wchłaniania, wydalania oraz transportu wewnątrzkomórkowego. W obrębie komórki pobieranie miedzi zachodzi dzięki transporterom błonowym CTR1 i CTR2, białka chaperonowe (ATOX1, COX17, CCS) transportują miedź w obrębie cytoplazmy, a ATPazy (ATP7A, ATP7B) regulują poziom miedzi w komórkach. Nadmiar miedzi zarówno na poziomie organizmu jak i pojedynczej komórki jest toksyczny, dlatego też konieczne jest zachowanie właściwego poziomu tego pierwiastka. Kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy miedzi w organizmie pełnią białka ATP7A i ATP7B. Białko ATP7B w wątrobie bierze udział we włączaniu kationów miedzi do cząsteczek ceruloplazminy. Mutacja genu ATP7B u ludzi i myszy prowadzi do akumulacji tego pierwiastka w wątrobie, ponieważ zaburza włącznie miedzi do cząsteczek ceruloplazminy i tym samym jej dalszy transport do krwioobiegu oraz do innych organów. ATP7B uczestniczy również w usuwaniu nadmiaru miedzi z organizmu wraz z żółcią. W przypadku mutacji ATP7B nadmiar miedzi nie może być usunięty z wątroby i dochodzi do gromadzenia tego pierwiastka, aż do poziomu toksycznego. Zgromadzona w wątrobie miedź prowadzi do zniszczenia hepatocytów, następnie uwalniana jest do krwioobiegu skąd trafia do innych narządów, w których dochodzi do akumulacji pierwiastka i uszkodzenia struktury narządu. U człowieka wspomniane zaburzenia metaboliczne nazwane są chorobą Wilsona. U pacjentów z chorobą Wilsona nadmiar miedzi usuwany jest częściowo przez nerki wraz z moczem. Organizmem modelowym do badań nad chorobą Wilsona są myszy z mutacją genu Atp7b tak zwane Toxic milk Jackson wyhodowane w Jackson Labolatory oraz myszy ze znokautowanym genem Atp7b (Atp7b -/-). Celem przeprowadzonych badań była analiza zawartości miedzi w nerce 6-miesięcznych mutantów Toxic milk Jackson oraz 6-miesięcznych zwierząt o genotypie dzikim. Analiza histologiczna nerek oraz ekspresji genów Atp7a oraz Slc31a1 (genu kodującego CTR1) w nerkach 6-miesięcznych myszy (txJ/ txJ) i osobników o genotypie dzikim. Zbadano również ekspresję i wewnątrzkomórkową lokalizację białek CTR1 i ATP7A, które w nerkach odpowiada za reabsorbcję miedzi z przesączu pierwotnego ponownie do krwioobiegu.Wyniki otrzymanych badań nie wskazują na akumulację miedzi w nerkach myszy mutantów. Natomiast obserwowano obniżoną ekspresję mRNA dla genów Atp7a i Slc31a1. Wykazano również zmianę lokalizacji wewnątrzkomórkowej białka CTR1 w nerkach mutantów. Wyniki analizy histologicznej nerki wykazały brak zmian patologicznych w budowie nerki mutantów.Copper is very important microelement, which is necessary for proper functioning of the organism. Due to its redox properties it is a cofactor for many enzymes which play key role in metabolic processes. Those enzymes are tyrosinase, cytochrome c oxidase, and ceruloplasmin or lysyl oxidase. Such enzymes catalyze processes like pigment formation, cellular respiration, iron metabolism or connective tissue formation. Maintaining proper levels of copper in the body is regulated by controlling its absorption, excretion and intracellular transport. Within the cell, copper uptake is achieved by CTR1 and CTR2 membrane transporters, chaperon proteins (ATOX1, COX17, CCS) transport copper within the cytoplasm and ATPase (ATP7A, ATP7B) regulate copper levels in cells. High copper level is toxic both for the organism and single cells, so it is necessary to maintain the proper level of copper. The main role in controlling copper homeostasis in the body have ATP7A and ATP7B proteins. ATP7B protein take part in copper bounding to apo form of ceruloplasmin. Mutation in ATP7B gene leads to copper accumulation in the liver, because this mutation affected copper bound to ceruloplasmin, so copper cannot release as Cu-ceruloplasmin complex to bloodstream. ATP7B also participates in removing excess copper from the body with the bile. ATP7B gene mutation leads to copper accumulation in the liver which results in hepatocytes damage. In the next step copper from damaged hepatocytes is released to bloodstream, and transported to other organs. In those organs copper accumulation affected the organ structure and function. Such metabolic disorder is called Wilson disease. In patients with Wilson's disease, excess copper is removed partially by the kidney with the urine. Mice with mutation in Atp7b gene are the animal model of Wilson disease. Mutation in Atp7b gene in mice arised in Jackson Laboratory and mutants are called Toxic milk Jackson.The aim of the study was analysis the copper content, expression of gene/protein copper transporters (CTR1 (Slc31a1), ATP7A) and histological analysis of the kidney of the kidney of 6-month-old Toxic milk Jackson mutants and control the 6-month-old wild type mice. ATP7A and CTR1 are responsible for copper reabsorption and transport copper back into the blood stream. The results of the present study indicate that copper concentration in the kidney of the mutants is only slightly higher than in control mice. It was also found that mRNA of Atp7a and Slc31a1 genes expression is lower in the kidney of the mutants. Intracellular localization of CTR1 protein showed apical localization of the protein in the cells of the renal tubules. Results of histological analysis showed no pathological changes in the mutants kidney