Expression of estrogen-related receptors (ERRs) after expourse to mixture of endocrine disrupters in mouse Leydig cells

Badania przeprowadzone w ostatnich latach pokazują, ze oprócz dobrze poznanych klasycznych receptorów estrogenowych ERα i ERβ na złożoność sygnalizacji estrogenowej mają wpływ również receptory pokrewne do receptorów estrogenowych, ERRs (ang. estrogen-related receptors). Mechanizm działania tych receptorów nie został do końca poznany, jednak uważa się, że działają one w sposób nieklasyczny, przez co rozumie się działanie w sposób pośredni lub bezpośredni. Ekspresja receptorów ERR została potwierdzona głównie w tkankach i narządach o dużym zapotrzebowaniu energetycznym, jak również w układzie rozrodczym samców, gdzie ich rola jest nadal przedmiotem badań.W niniejszej pracy po raz pierwszy zbadano immunolokalizację receptorów ERRα, ERRβ, ERRγ w komórkach Leydiga in vitro pobranych od samców myszy szczepu C57BL oraz wpływ mieszaniny polichlorowanych naftalenów na ekspresję tych receptorów. Komórki traktowano mieszaniną polichlorowanych naftalenów (ang. polichlorated naphtalens), PCNs osobno oraz w kombinacji z jednym z antagonistów receptorów hormonów steroidowych: antagonistą receptorów estrogenowych, (ICI 182,780), antagonistą receptora estrogenowego sprzężonego z białkiem G, (G15) oraz antagonistą receptora androgenowego, hydroksyflutamidem (HF). Dodatkowo, zbadano poziom sekrecji hormonów steroidowych oraz poziom jonów wapnia, po ekspozycji na PCN, które zaangażowane są w regulację procesu steroidogenezy w komórkach Leydiga. Badania przeprowadzono przy użyciu metod: RT-PCR w czasie rzeczywistym, qRT-PCR, barwienia immunocytochemicznego, techniki radioimmunologicznej (ang.Radio Immuno Assay), RIA oraz techniki kolorymetrycznej.Wyniki przeprowadzonych badań wykazały ekspresję na poziomie mRNA i białka wszystkich trzech typów receptorów ERR w komórkach Leydiga. Ekspozycja komórek Leydiga na mieszaninę PCN znacznie zwiększała ekspresję mRNA poszczególnych ERRs. Jednocześnie wykazano podwyższony poziom jonów wapnia i hormonów steroidowych w komórkach traktowanych mieszaniną PCN. Wykazano, że zmiany ekspresji receptorów ERRs na poziomie mRNA są wyraźnie skorelowane ze zmianami poziomu jonów wapnia i hormonów steroidowych. Ekspozycja na związki z grupy antagonistów receptorów nie miała wpływu na zmianę ekspresji receptorów ERR. Badania wykazały, że zarówno receptory estrogenowe (ERα i ERβ) jak i receptor androgenowy nie biorą udziału w sygnalizacji zależnej od PCN w komórkach Leydiga. Wyniki przeprowadzonych analiz wskazują, że polichlorowane naftaleny modulują ekspresję receptorów ERR w komórkach Leydiga.The complexity of estrogen signalling in besides classical estrogen receptors ERα and ERβ is also influenced by estrogen-related receptors, ERRs. The mechanism of action of these receptors has not been fully identified, but it is considered that they act in a non-classical way, directly or indirectly. The expression of ERR receptors has been confirmed mainly in tissues and organs with high energy demand, as well as in male reproductive system, where their role is still being investigated. The aim of the study was to localize ERRs receptors and to investigate the expression at the level of mRNA in mouse Leydig cells. Cells were treated with a mixture of polychlorated naphtalens, separately and in combination with one of the steroid hormone receptor antagonists: an estrogen receptor antagonist, (ICI 182,780), GPER antagonist, (G15) and androgen receptor antagonist, hydroksyflutamide (HF). Additionally, the level of secretion of steroid hormones and the level of calcium ions after exposure to PCNs, which are involved in steroidogenesis control in Leydig cells were examined using different methods: real-time RT-PCR, qRT-PCR, immunocytochemical staining (ICC), Radio Immuno Assay (RIA) and colorimetric technique.Results of the study showed expression at the level of mRNA and protein of all three types of ERRs receptors in Leydig cells. Exposure of Leydig cells to the PCN mixture significantly increased the expression of mRNA ERRs. Increased levels of calcium ions and steroid hormones in the PCN mixed cells were demonstrated. Changes in expression of ERRs receptors at mRNA level are clearly correlated with changes in calcium ion levels and steroid hormones. Exposure to receptor antagonists did not affect the expression of ERRs receptors. Neither estrogenic (ERα, ERβ) nor androgen receptor are involved in PCN dependent signalling in Leydig cells. All results indicate that PCNs modulate the expression of mRNA ERR receptors