The analylis of proteins modification in NETs induced by proteases secreted by Porphyromonas gingivalis

Zewnątrzkomórkowe sieci neutrofilowe to jeden z mechanizmów odpowiedzi wrodzonej. Stanowią sieć zbudowaną z chromatyny i białek, której działanie polega na pułapkowaniu i inaktywacji patogenów poprzez wysokie lokalne stężenie czynników bakteriobójczych występujących w sieciach. Badania wykazały indukcję NETs pod wpływem wielu czynników wirulencji drobnoustrojów, w tym pod wpływem gingipainy HRgpA, enzymu proteolitycznego pochodzącego z bakterii gatunku Porphyromonas gingivalis. Udowodniono, że NETs wyidukowane przez gingipainę nie posiadają jednakże potencjału bakteriobójczego wobec macierzystych bakterii, a mechanizm tego zjawiska pozostał niewyjaśniony. W związku z powyższym, w niniejszej pracy postanowiono zbadać aktywność biologiczną komponentów NETs wyidukowanych gingipainą HRgpA i porównać w aktywnością komponentów NETs wyidukowanych przez octan mirystynianu forbolu (PMA), czynnik powszechnie stosowany w praktyce laboratoryjnej do indukcji NETs. Uzyskane wyniki potwierdziły obniżony poziom aktywności czynników o charakterze bakteriobójczym w sieciach neutrofilowych wygenerowanych gingipainą w porównaniu do NETs-PMA. Równolegle postanowiono ocenić, czy proces ten determinowany jest aktywnością proteolityczną gingipainy HRgpA. W tym celu przeprowadzono analizę komponentów NETs wyindukowanych inaktywowaną, za pomocą specyficznych inhibitorów Kyt-1 i Kyt-36, gingipainą HRgpA. Wyniki eksperymentu potwierdziły zależność tego efektu od aktywności proteolitycznej gingipainy HRgpA. Ostatnim etapem badań było porównanie przeżywalności bakterii gatunku Streptococcus salivarius w sieciach neutrofilowych wyidukowanych HRgpA i PMA. Uzyskany wynik wykazał znaczne obniżenie potencjału bakteriobójczego NETs wygenerowanych gingipainą. Podsumowując, przeprowadzone badania sugerują, iż gingipaina HRgpA prowadzi do powstawania dużej ilości niefunkcjonalnych bakteriobójczo sieci neutrofilowych i może stanowić potwierdzenie dla hipotezy, która wskazuje na rolę gingipain w mechanizmach obronnych wobec NETs.Neutrophil extracellular traps (NETs) is one of the major players in innate immune defense mechanism. They are composed of chromatin and bactericidal proteins, which capture and inactivate the pathogens during infection. Recent studies have shown that many factors are able to induce NETs, such as gingipains, which is a type of proteolytic enzyme secreted by Porphyromonas gingivalis. It was shown that NETs induced by gingipains do not exert antibactericidal activity against Porphyromonas gingivalis and this paradox has stimulated the interest to conduct further investigation on this study. It was proved that the biological activity of NETs induced by gingipains is different from NETs generated by phorbol myristate acetate, a strong inducer of NETs. The formation of NETs is dependent on gingipains proteolytic activity, which was proved by using specific gingipain inhibitors, Kyt-1 and Kyt-36. Further studies were conducted to compare the bactericidal function of NETs against other bacteria of the oral cavity, such as Streptococcus salivarius. Obtained data has shown that NETs induced by gingipains are ineffective comparing to NETs-induced by PMA. To summarize, the results suggest that NETs induced by gingipains are ineffective and it could be the mechanism of P. gingivalis self-protection