Investigation of the morphology of the liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) by atomic force microscopy (AFM) and fluorescent miscoscopy

Komórki śródbłonka zatok wątroby (LSECs – ang. Liver Sinusoidal Endothelial Cells) posiadają charakterystyczne struktury zwane fenestracjami. Zgrupowane w sita fenestracje są nieposiadającymi membrany otworami w błonie komórkowej umożliwiającymi przenikanie substancji pomiędzy światłem naczyń a przestrzenią Dissego. Ich częściowy zanik lub całkowita nieobecność może świadczyć o patologicznych stanach narządu. Ze względu na niewielkie rozmiary pojedynczych fenestracji, wynoszące 80-200 nm, ich badanie nie jest możliwe przy wykorzystaniu tradycyjnych metod optycznych. Celem niniejszej pracy było zbadanie możliwości zastosowania mikroskopii sił atomowych do analizy morfologii komórek LSECs w kontekście przyszłych badań niealkoholowego stłuszczenia wątroby. Porównanie dostępnych trybów pracy mikroskopu pozwoliło na stwierdzenie, iż tryb kontaktowy najlepiej sprawdza się w badaniu komórek utrwalonych, natomiast tryb obrazowania ilościowego jako jedyny umożliwia pomiar fenestracji w żywych komórkach. Na koniec przedstawiono mikroskopię fluorescencyjną jako technikę komplementarną do mikroskopii AFM oraz służącą do oceny czystości populacji izolowanych komórek.The Liver Sinusoidal Endothelial Cells (LSECs) are unique endothelial cells characterized by the presence of transmembrane, non-diaphragmed fenestrations. Groups of 10-20 fenestrations create so called sieve plates, which are involved in transportation of lipoproteins and chylomicrons between bloodstream and a space of Disse. Diameter od single fenestration is about 50-200 nm and it varies depending on the species. The alterations of LSECs morphology can determine pathological states of the liver. Because of the size of fenestrations, its can not be investigated using traditional optical microscopy. The aim of this study is to show the opportunities of applying AFM techniques to examine changes in the cell morphology in early stages of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD). Comparison of the available AFM work modes indicate the conclusion that the contact mode is the most appropriate for investigation of fixed cells and that the only mode with sufficient resolution for studying morphology changes in the sieve plates and the fenestrations of living cells is the quantitative imaging. Finally, the fluorescent microscopy has been presented as a technique complementary to AFM and also applied for evaluation of the purity of the isolated cell population