Optymalizacja testu aktywności oksygenazy hemowej (HO) oraz poszukiwanie nowych inhibitorów HO-1

Oksygenaza hemowa (HO) jest enzymem odpowiedzialnym za rozkład hemu do tlenku węgla (CO), dwuwartościowego jonu żelaza (Fe2+) oraz biliwerdyny, która w wyniku działania reduktazy biliwerdyny (BVR) jest natychmiastowo redukowana do bilirubiny. Ze względu na ważną rolę metabolitów hemu, HO można uznać za regulator komórkowej homeostazy. Istnieją dwie najważniejsze izoformy HO: indukowalna HO-1 oraz konstytutywna HO-2. Indukcja HO-1 może nastąpić przez szereg różnych czynników, takich jak: hem, stres oksydacyjny, prostaglandyny, tlenek azotu czy niektóre cytokiny. Ponadto, HO-1 może ulegać nadekspresji w niektórych stanach chorobowych, w tym w pewnych nowotworach. Specyficzna inhibicja tego enzymu mogłaby zostać wykorzystana jako terapia przeciwnowotworowa, poprzez zwiększenie wrażliwości komórek nowotworowych na chemioterapię oraz radioterapię. Niestety, poznane do tej pory inhibitory HO mają ograniczone zastosowanie w klinice. Często stosowane w badaniach in vitro metaloporfiryny (MPs) są inhibitorami mało specyficznymi, charakteryzującymi się licznymi efektami ubocznymi, w tym zwiększaniem poziom transkryptu HO-1. Z drugiej strony, w przypadku innej grupy inhibitorów: pochodnych imidazolowych, wciąż brak jest szczegółowych informacji na temat ich farmakokinetyki oraz biodystrybucji. Celem prezentowanej pracy było otrzymanie nowych cząsteczek hamujących aktywność oksygenazy hemowej. Ponadto, część badań poświęcona była optymalizacji testu aktywności HO wykorzystującego ekstrakcję bilirubiny z użyciem chloroformu. Modyfikacje protokołu dotyczyły w dużej mierze zmiany źródła reduktazy biliwerdyny (BVR). Naszym celem było użycie oczyszczonej reduktazy biliwerdyny zamiast szczurzego cytozolu wątrobowego. W celu standaryzacji metody stężenie oczyszczonego BVR, wynoszące 25 µg/mL zostało wybrane i jest rutynowo używane w naszym laboratorium. Zoptymalizowany test aktywności wykorzystany został do porównania efektywności hamowania HO przez nowe inhibitory w odniesieniu do znanych już związków. Zarówno protoporfiryna cyny (SnPPIX) i cynku (ZnPPIX) bardzo silnie zmniejsza aktywność HO w linii komórek raka trzustki PANC-1. Przesiewowe badanie biblioteki nowych związków doprowadziło do wyboru dwóch najsilniej działających inhibitorów o efektywności zbliżonej do SnPPIX. Uzyskane wyniki wskazują, że nowe inhibitory HO są interesujące i mogą mieć potencjalne zastosowanie. W związku z tym należy przeprowadzić dalsze testy w celu eksploatacji możliwości ich zastosowania w klinice.Heme oxygenase (HO) is an enzyme which degrades heme to carbon monoxide (CO), ferrous ion (Fe2+) and biliverdin that is immediately reduced by biliverdin reductase (BVR) to bilirubin. Due to the important role of heme metabolites, HO can be considered as a regulator of cellular homeostasis. There are two most important isoforms of HO: inducible HO-1 and constitutively expressed HO-2. HO-1 can be induced by wide spectrum of factors, like heme, oxidative stress, prostaglandins, nitric oxide and some cytokines. Moreover, HO-1 can be overexpressed in some pathological conditions, including certain tumors. Specific inhibition of this enzyme may be considered as an anti-tumor treatment that could increase sensitivity of cancer cells to chemotherapy or radiotherapy. Unfortunately, so far described inhibitors are of limited application in clinics. Widely used in in vitro studies, metalloporphyrins (MPs) are unselective and exert many side effects including increase in HO-1 mRNA level. On the other hand, detailed information about pharmacokinetics and biodistribution of the recently developed, new compounds (imidazole-dioxolane derivatives) is lacking. The aim of a present study was to obtain new compounds able to inhibit HO activity. Moreover, we focused on the optimization of the HO activity assay based on the extraction of bilirubin with chloroform. The optimization of the protocol includes the application of purified rat biliverdin reductase (BVR) protein instead of rat liver cytosol as a source of biliverdin reductase. We standardized the assay and routinely use 25 µg/mL concentration of BVR. We applied HO activity assay to compare the effectiveness of known HO inhibitors with newly synthesized compounds. Both tin (SnPPIX) and zinc (ZnPPIX) protoporphyrins very potently diminished HO activity in pancreatic cancer cell line, PANC-1. Screening of the library of new compounds led to the selection of two most potent inhibitors. Obtained results indicate that our novel HO inhibitors are of potential interest; therefore further tests should be performed to fully establish their potential applications as anti-cancer drugs