Research on the influence of PemKSa toxin on switching to persister state in Staphylococcus aureus

Komórki o fenotypie „persister” stanowią subpopulację występującą w hodowli mikroorganizmów, która jest w stanie przeżyć ekspozycję na antybiotyki w stężeniu wielokrotnie przekraczającym dawkę śmiertelną dla większości populacji. Uważane są za jedną z przyczyn trudności w leczeniu chronicznych i nawracających infekcji. W związku z tym istnieje potrzeba badania mechanizmów odpowiadających za warunkowaną fenotypowo tolerancję na środki przeciwdrobnoustrojowe. Zdolność do przechodzenia w stan „persister” zaobserwowano między innymi u bakterii z gatunku Staphylococcus aureus, groźnych patogenów oportunistycznych ludzi i zwierząt.Wśród czynników intensywnie badanych w kontekście powstawania fenotypu „persister” znajdują się układy toksyna-antytoksyna (TA), najczęściej dwuczęściowe elementy genetyczne powszechnie występujące w genomach mikroorganizmów.Celem pracy było zbadanie wpływu toksyny PemKSa należącej do układu toksyna-antytoksyna pemIKSa na powstawanie komórek o fenotypie „persister” u bakterii gatunku S. aureus. Wykazano związek układu toksyna-antytoksyna pemIKSa z tworzeniem komórek o fenotypie „persister” prezentujących tolerancję na penicylinę G oraz rifampicynę przez bakterie z gatunku S. aureus. Ektopowa ekspresja genu toksyny PemKSa doprowadziła do kilkudziesięciokrotnego wzrostu przeżywalności komórek w hodowlach S. aureus poddanych działaniu penicyliny G w stężeniu równym 20μg/ml i 1μg/ml oraz około 10-krotnego wzrostu przeżywalności w obecności rifampicyny w stężeniu 0,375μg/ml. W kolejnej części pracy podjęto próbę aktywacji natywnego systemu toksyna-antytoksyna pemIKSa wprowadzonego na plazmidzie do szczepu S. aureus RN4220. W tym celu użyto szoku cieplnego o długości 10min w temperaturze 45˚C. Izolacja komórek typu „persister” za pomocą penicyliny G w stężeniu równym 20μg/ml i 1μg/ml nie wykazała różnic pomiędzy ich liczbą w szczepie posiadającym układ TA pemIKSa i szczepie kontrolnym, co pośrednio wskazuje że zastosowane warunki nie były wystarczające do aktywacji układu.Powiązanie systemu TA pemIKSa z tworzeniem komórek o fenotypie „persister” przez bakterie z gatunku S. aureus umieszcza PemKSa wśród innych toksyn z układów TA zdolnych do wprowadzania komórek w stan tolerancji na antybiotyki. Szczególnie liczną ich część stanowią toksyny z układów TA typu II wykazujące aktywność RNAzy.Persister cells consist a subpopulation in a microorganism culture that is capable of surviving exposure to antimicrobials at concentrations many times exceeding the lethal dose for the majority of the population. They are considered to be one of the causes of the difficulties with the treatment of chronic and recurrent infections. Therefore, there is a need for studying of mechanisms responsible for phenotypically conditioned tolerance to antimicrobials. The ability to switch to persister state was observed among others in Staphylococcus aureus, dangerous opportunistic pathogens of humans and animals.Among the extensively investigated factors contributing to the formation of the persister phenotype there are toxin-antitoxin (TA) systems, mostly two-part genetic elements commonly found in the genomes of microorganisms.The aim of this study was to investigate the influence of PemKSa toxin belonging to pemIKSa toxin-antitoxin system on switching to persister state in S. aureus. A linkage between pemIKSa toxin-antitoxin system and the formation of S. aureus persister cells tolerant to penicillin G and rifampicin was established. Ectopic expression of PemKSa toxin led to a few dozen times increase in the survival of cells in S. aureus cultures exposed to 20μg/ml or 1μg/ml of penicillin G and about tenfold increase in survival in the presence of 0.375μg/ml rifampicin.In the next part of this work an attempt to activate the native pemIKSa toxin-antitoxin system introduced on a plasmid to S. aureus strain RN4220 was made. In order to do this 10 minutes 45˚C heat shock was used. Isolation of the persister cells using 20μg/ml or 1μg/ml penicillin G showed no differences between the number of persister cells in the strain with pemIKSa TA system and the negative control, which indicates that the conditions were not sufficient to activate the system.Connecting the pemIKSa TA system with the forming of S. aureus persister cells makes PemKSa one of other toxins from TA systems able to induce the state of antimicrobial tolerance in cells. A particularly large part of them are toxins from the type II TA systems with an RNAse activity