Phenotypic and Genotypic Identification clinical strains of Staphylococcus epidermidis isolated from children from Intensive Care Units including characterization of sensitivity to glycopeptides and silver nanoparticles

Staphylococcus epidermidis, gatunek zaliczany do grupy gronkowców koagulazo-ujemnych-CNS (ang. Coagulase Nagative Staphylococci), stanowi składnik flory fizjologicznej skóry i błon śluzowych człowieka. Do niedawna drobnoustrój ten uważano za niechorobotwórczy dla ludzi. Obecnie jednak wiadomo, że S. epidermidis stanowi jeden z czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych. Do celów niniejszej pracy należała identyfikacja fenotypowa i genotypowa badanych szczepów S. epidermidis oraz wykrywanie genu oporności na metycylinę metodą multiplex PCR. Celem pracy była również identyfikacja u badanych izolatów mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe i makrolidy oraz ocena wrażliwości badanych szczepów na antybiotyki glikopeptydowe. W pracy dokonywano także oceny antybakteryjnej aktywności nanocząsteczek srebra wobec badanych szczepów Staphylococcus epidermidis i wzorcowego szczepu Escherichia coli.Przebadano 28 klinicznych szczepów S. epidermidis izolowanych z materiałów klinicznych pochodzących z różnych Oddziałów Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie. Badania przeprowadzano w Zakładzie Mikrobiologii Farmaceutycznej UJ CM. Dla każdego szczepu potwierdzono identyfikację gatunkową na podstawie wyników badań fenotypowych, testu biochemicznego API Staph (bioMérieux) oraz badania genetycznego (multiplex PCR). Identyfikacja fenotypowa obejmowała ocenę makroskopową wzrostu na podłożu krwawym z dodatkiem 5% krwi baraniej, ocenę mikroskopową preparatów barwionych metodą Grama, testy oceniające zdolność do wytwarzania katalazy, clumping factor i koagulazy wolnej, ocenę fermentacji mannitolu na podłożu Chapmana oraz wrażliwości na nowobiocynę. Metodę dyfuzyjno-krążkową wykorzystano identyfikacji mechanizmów oporności na metycylinę oraz makrolidy, linkozamidy i streptograminy B. Metoda ilościowa E-test posłużyła do oceny wrażliwości na wankomycynę i teikoplaninę. Obecność mechanizmu oporności na metycylinę, poprzez wykrywanie obecności genu mecA, potwierdzono metodą multiplex PCR. Otrzymane wyniki badań fenotypowych oraz testu biochemicznego API Staph pozwoliły na identyfikację badanych szczepów klinicznych jako S. epidermidis, co potwierdzono badaniami genetycznymi. Oporność na metycylinę metodą dyfuzyjno-krążkową wykazano dla 82% badanych szczepów, natomiast metodą genetyczną dla 89%, co stanowiło 93% zgodność uzyskanych wyników. Konstytutywny fenotyp oporności MLSB wykazano dla 25% badanych szczepów, oporność MLSB o charakterze indukcyjnym dla 28,5% natomiast oporność typu MSB dla 28,5%. Dla wszystkich badanych szczepów wykazano wrażliwość na wankomycynę, 28,5% izolatów charakteryzowało się opornością na teikoplaninę. W niniejszej pracy oceniano również antybakteryjną aktywność nanocząsteczek srebra. Wrażliwość klinicznych szczepów S. epidermidis oraz wzorcowego szczepu E. coli ATCC 25922 na nanocząsteczki srebra oceniano wykorzystując metodę dyfuzyjno-krążkową z krążkami nasączonymi roztworami nanocząsteczek srebra, metodę „kropli”, w której roztwory nanocząsteczek nakrapiano na podłoże z rozprowadzoną zawiesiną bakteryjną oraz metodę z nanocząsteczkami zainkorporowanymi w podłoże agarowe.Uzyskane w niniejszej pracy wyniki potwierdziły antybakteryjne właściwości nanocząsteczek srebra. Badania potwierdziły zależność uzyskanych wyników od stężenia nanocząsteczek, a równocześnie od rodzaju szczepu i jego wrażliwości na antybiotyki. Większą wrażliwość na Ag-NPs uzyskano w przypadku szczepu S. epidermidis MSSE (wrażliwego na metycylinę) w przeciwieństwie do szczepu S. epidermidis MRSE (opornego na wszystkie antybiotyki β-laktamowe). Duże znaczenie mają prawdopodobnie także różnice w budowie ściany komórkowej S. epidermidis i E. coli. Uzyskane wyniki wskazują na większą wrażliwość na nanocząsteczki srebra bakterii Gram-dodatnich. Badania należałoby rozszerzyć i przeprowadzić na większej liczbie szczepówStaphylococcus epidermidis accounted to Coagulase Negative Staphylococci comprise part of the physiological flora of skin and mucosal membranes in humans. Until recently was considered as non pathogenic. Now it is well established that S. epidermidis is a main etiological factor of intrahospital infections connected with implantation of biomaterials and implementation of urinary and intravenous catheters. The aim of this work was phenotype and genotype identification of selected strains of S. epidermidis and detection of methicillin resistance gene by multiplex PCR method. Identification of mechanism of drug resistance against β-lactam antibiotics and macrolides was performed with accordance with EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Estimation of sensitivity for glycopeptides was performed by E-test method. Antibacterial activity of silver nanoparticles against selected strains of S. epidermidis and reference strain of Escherichia coli was also performed. 28 clinical strains of S. epidermidis isolated from patients of several departments of Children Hospital in Krakow were investigated. Laboratory experiments were performed in Department of Pharmaceutical Microbiology UJCM. For each strain confirmation of the genotype was performed on the basis of the phenotype analysis, biochemical test–API Staph (bioMérieux), and genetic confirmation (multiplex PCR). Phenotype identification included macroscopic examination of growth on 5% sheep blood agar bacterial growth medium. Microscopic examination was performed by Gram staining procedure. Additionally catalase, clumping factor, free coagulase, evaluation of mannitol fermentation in Chapman medium and novobiocin sensitivity tests for bacterial identification were performed. Radial diffusion tests for the determination of sensitivity of the selected strains for cefoxitin, erythromycin, clindamycin and for the identification of the mechanisms of methicillin, macrolides, lincosamides and streptogramines B resistance were performed. Quantitative E-test diffusion method (using strips soaked with drug gradient) was performed for the estimation of sensitivity for vancomycin and teicoplanin. Detection of the mecA gene triggering methicillin resistance was performed by multiplex PCR.Results of phenotype identification and biochemical API Staph tests confirmed identification of selected clinical strains as S. epidermidis what was confirmed by genome analysis methods. Methicillin resistance determined was detected in 82% of the strains by radial diffusion method and in 89% by gene analysis technology what yields 93% concurrent validity. Obtained results enabled identification of constitutive phenotype of drug resistance MLSB for 25% of strains, inductive resistance MLSB for 28,5% of strains and MSB resistance for 28,5% of strains. All investigated strain were vancomycin sensitive and 28,5% of isolates were teicoplanin resistant. In current work evaluation of antibacterial activity of silver nanoparticles was investigated. Sensitivity of clinical strains of Staphylococcus epidermidis and reference strain of Escherichia coli ATCC 25922 was evaluated by radial diffusion method using rings soaked in silver nanoparticles solution, drop method where solutions of silver nanoparticles were implemented on bacterial covered surface and using nanoparticles incorporated in agar medium.Silver nanoparticles exhibit antibacterial properties. Experiments confirmed relationship between strain type its antibiotics sensitivity and concentration of silver nanoparticles. It was demonstrated that methicillin sensitive S. epidermidis displayed higher sensitivity on silver nanoparticles as opposed to MRSE S. epidermidis strain resistant to all β-lactam antibiotics. Differences in bacterial wall construction between S. epidermidis and E. coli are probably of great importance. Obtained results denote higher sensitivity of Gram-positive bacteria on the silver nanoparticles