Preparation and testing of strains and plasmids for testing the accuracy of homologous recombination in the cells of Saccharomyces cerevisiae

Rekombinacja homologiczna w organizmie odgrywa ważną rolę. Odpowiada między innymi za naprawę DNA sprzyjając stabilności genomu. W naturalny sposób występuje w mejozie gdzie odpowiada za prawidłową segregację chromosomów. Może być wykorzystywana w celowanej terapii genowej i przy tworzeniu kaset oporności lekowej. U wielu organizmów, w tym u wykorzystywanych w tych badaniach drożdży piekarniczych, występuje niska naturalna mutagenność rekombinacji poświadczona specyficznymi zmianami sekwencji DNA nagromadzonymi w trakcie filogenezy. Celem niniejszej pracy było sprawdzenie czy w czasie rekombincji wymuszonej w warunkach laboratoryjnych częstość mutacji jest szczególnie wysoka. Sprawdzano czy istnieje możliwość wprowadzenia metody rekombinacji bez zastosowania dodatkowego markera, a przy zaniku markera już obecnego, tak by zachodziła selekcja negatywna. W eksperymencie wykorzystano dwa haploidalne szczepy drożdży BY4741, które różniły się w locus HO. Szczep kontrolny w tym locus miał gen nat (oporność na nurseotrycynę) natomiast szczep eksperymentalny gen URA3. W szczepie kontrolnym zaobserwowano poprawne zajście rekombinacji homologicznej natomiast w szczepie eksperymentalnym doszło do inaktywacji kasety genu URA3. Dla dwudziestu klonów szczepu eksperymentalnego zanalizowano sekwencje DNA. Wykryto mutacje i konwersje genów. Były to niezamierzone zamiany genów poprzez rekombinacje homologiczną. Uzyskane wyniki wskazują, że standardowa metoda transformacji oparta o octan litu nie jest znacząco mutagenna. Mutacje punktowe i konwersje genów są co najwyżej lekko częstsze niż w czasie normalnego wzrostu. Zamierzone rekombinacje zachodziły odpowiednio często w szczepie kontrolnym ale, z niewyjaśnionych przyczyn, nie stwierdzono ich w szczepie eksperymentalnym. Tym samym, nie udało się wypracować metody, która pozwalałaby podmieniać jeden gen na drugi bez wprowadzenia dodatkowego markera.Homologous recombination plays a major role in the body. It is responsible, among other things, for DNA favoring genomic stability. In a natural way it occurs in meiosis, where it is responsible for the proper segregation of chromosomes. It can be used for targeted gene therapy and the formation of drug resistance cassettes. In many organisms, which are used in these studies budding yeast, it is low inherent mutagenesis of recombination, which is certified by specific DNA sequence changes, accumulated during phylogeny. The aim of this study was to verify the time of recombination forced under laboratory conditions the mutation rate is particularly high. It was checked that there is a possibility of introducing a recombinant method without the use of additional marker and within vanishing of already present marker, so that the negative selection occurred. The experiment involved two haploid yeast strain BY4741 which differed HO locus. A control strain at this locus had nat gene (resistance to nourseothricin), while the experimental strain URA3 gene. In the control strain, it was observed correct homologous recombination occurrence, whereas in the experimental strain there was a URA3 gene inactivation cassette. For the twenty clones of experimental strains it were analyzed DNA sequences. Detected mutations and gene conversion. Were the conversion unintended gene by homologous recombination. The results obtained indicate that the standard method of transformation, based on a lithium acetate, is not substantially mutagenic. Point mutations and gene conversions are just slightly more frequent than during normal growth. The intended recombination occurred frequently enough in the control strain but with unknown causes, it was not observed in the experimental strain. In this way, it failed to develop methods that would allow to swap one gene to another without adding additional marker