The influence of butylated hydroxyanisole on cell viability under in vitro conditions.

Butylohydroksyanizol jest organicznym związkiem chemicznym, pochodną anizolu, jednym z najpopularniejszych przeciwutleniaczy syntetycznych, z grupy syntetycznych fenoli. Substancja ta jest powszechnie wykorzystywana w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, chemicznym i farmaceutycznym. Związek ten dostaję się do organizmu człowieka głównie drogą pokarmową, oddechową oraz przez skórę. BHA był uważany przez wiele lat za związek niekancerogenny. Dopiero wyniki badań Ito i wsp. z 1983r. wykazały, że BHA zastosowany w wyższych dawkach i przy dłuższym czasie narażenia wywołuje hiperplazję, brodawczaki i raka przedżołądka u szczurów F-344. Dotychczasowe dane literaturowe dotyczące potencjalnego, cytotoksycznego działania BHA są kontrowersyjne. Cytotoksyczne działanie tego związku obserwowano zarówno w komórkach nowotworowych jak i w komórkach nerki. z drugiej strony BHA hamuje indukowaną stresem oksydacyjnym apoptozę w komórkach układu immunologicznego. Ponieważ BHA jest związkiem lipofilnym, który może przechodzić do mózgu, dlatego nie można wykluczyć jego wpływu na komórki centralnego systemu nerwowego (CSN). z jednej strony związek ten ze względu na swoje antyoksydacyjne działanie może wywierać efekty ochronne, z drugiej jednak strony ponieważ komórki CSN, szczególnie neurony, są bardzo wrażliwe na działanie czynników uszkadzających także nie można wykluczyć neurotoksycznego działania tego związku. Celem niniejszej pracy było określenie wpływu BHA na żywotność komórek ludzkiej neuroblastomy (SH-SY5Y). Zbadano również wpływ tego związku na wywoływane nadtlenkiem wodoru (H2O2) uszkodzenia neuronów. Działanie BHA na komórki SH-SY5Y badano oznaczając w pożywce hodowlanej poziom dehydrogenazy mleczanowej (LDH, enzymu wydostającego się z uszkodzonych komórek) oraz określając aktywność dehydrogenaz mitochondrialnych (enzymów aktywnych w żywych, nieuszkodzonych komórkach). Określano wpływ BHA w zakresie stężeń 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, dodawanego do pożywki hodowlanej na 24 h i 72 h, w warunkach podstawowych oraz przy uszkadzaniu komórek 0.5 mM nadtlenkiem wodoru.Wykazano, że butylohydroksyanizol we wszystkich stężeniach, obecny w pożywce przez 72 h, powodował zwiększenie żywotności komórek linii SH-SY5Y, oznaczane testem redukcji MTT oraz zmniejszał uszkodzenia błony komórek, przejawiające się obniżeniem aktywności LDH w medium. Dodanie BHA do hodowli na 24 h nie wywierało istotnych efektów, chociaż w teście MTT obserwowano tendencję w kierunku nasilania żywotności komórek. W badaniu zastosowano także nadtlenek wodoru, uzyskując w ten sposób model stresu oksydacyjnego. H2O2 statystycznie istotnie zmniejszał aktywność komórek SH-SY5Y. Analiza otrzymanych wyników wykazała, że BHA we wszystkich badanych stężeniach statystycznie istotnie hamował wywołany przez H2O2.wzrost aktywności LDH oraz osłabiał obniżenie redukcji MTT. Efekt taki obserwowano zarówno przy 24 h jak i 72 h obecności H2O2 w pożywce hodowlanej.Podsumowując, butylohydroksyanizol zastosowany w powyżej podanych stężeniach, wykazuje działanie neuroprotekcyjne na komórki hodowane zarówno w warunkach podstawowych jak i poddane uszkadzającemu działaniu H2O2. Otrzymane wyniki należy jednak interpretować ostrożnie, gdyż działanie tego związku w warunkach in vivo nie musi być takie samo oraz fakt, że długotrwałe narażenie na BHA in vitro, czy zastosowanie go w wyższych stężeniach może wywołać efekty cytotoksycznie.Butylated hydroxyanisole is an organic chemical compound, anisole derivative, one of the most common synthetic antioxidants, from the group of synthetic phenols. This substance is widely used in food, cosmetic, chemical and pharmaceutical industries. This compound is gets into the human body mainly by ingestion, inhalation and through the skin. For many years BHA was considered as non-carcinogenic compound. No sooner than after the publication of the results of Ito et al, 1983 was it showed that the BHA used at higher doses and for a longer period of exposure induces hyperplasia, papillomas and forestomach carcinoma in rats F-344. The existing literature data regarding the potential cytotoxic effects of BHA are controversial. The cytotoxic effects of this compound have been observed both in tumor cells and in kidney cells. On the other hand, BHA inhibits oxidative stress-induced apoptosis in cells of the immune system. Since the BHA is lipophilic compound that can pass into the brain, its effect on cells of the central nervous system (CSN) cannot be excluded. On the one hand this compound because of its antioxidant action can exert protective effects. On the other hand, because the CSN cells, particularly neurons are very sensitive to damaging factors neurotoxic effects of this compound cannot be excluded . The aim of this study was to determine the effect of BHA on cell viability of human neuroblastoma (SH-SY5Y). The effect of this compound on hydrogen peroxide-induced (H2O2) neuronal damage was also examined. The activity of BHA on SH-SY5Y cells was tested determining in the culture medium lactate dehydrogenase level (LDH, the enzyme escaping from damaged cells) and by determining the activity of mitochondrial dehydrogenases (enzymes active in living, intact cells). The effects of BHA at a concentration range of 10-6 , 10-5, 10-4, 10-3 M added to the culture medium for 24 and 72 hours, under basal conditions and at the damage of cells with 0.5 mM hydrogen peroxide was determined It was shown that butylated hydroxyanisole at all concentrations present in the culture medium for 72 hours, induced the increase in the viability of SH-SY5Y line cells, assayed by MTT reduction test and reduced the cell membrane damage, manifested by a decrease in LDH activity in the medium. In the study hydrogen peroxide was also used, the result of which was obtaining a model of oxidative stress. H2O2 significantly reduced the activity of SH-SY5Y cells. The analysis of the results showed that the BHA at all concentrations statistically significantly inhibited induced by H2O2 increase in the LDL activity and caused weakening of MTT reduction. This effect was observed at both 24 - and 72-hour presence of H2O2 in the culture medium.In conclusion, butylated hydroxyanisole applied in the stated above concentrations, shows the neuro-protective activity with reference to cells cultured both in basic conditions and subjected to the damaging action of H2O2. The obtained results should be interpreted with caution, since the effect of this compound in vivo may not be the same, and the fact that prolonged exposure to BHA in vitro, or apply it in higher concentrations can induce cytotoxic effects