Studies on influence of NO into functional state of erythrocytes by using raman spectroscopy

Celem pracy magisterskiej było zbadanie oddziaływania tlenku azotu z hemoglobiną ludzkich erytrocytów, a w szczególności ustalenie stanu spinowego i stanu utlenienia jonu żelaza w adduktach hemoglobiny z tlenkiem azotu z wykorzystaniem metod biochemicznych i spektroskopowych.Krew otrzymywaną od zdrowych dawców poddawano izolacji poprzez łagodne wirowanie celem uzyskania czystej frakcji izolowanych erytrocytów. Tlenek azotu pochodził ze specjalnych związków donorowych: PAPA-NO, który uwalnia tlenek azotu stosunkowo wolno (t1/2 = 15 minut), oraz DEA-NO, który znacznie szybciej uwalnia NO (t1/2 = 2 minuty). W pracy wykorzystano badania gazometryczne i morfologiczne oraz trzy metody spektroskopowe: rezonansową spektroskopię Ramana, spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego oraz spektroskopię absorpcyjną UV-Vis.Na podstawie wykonanych doświadczeń stwierdzono, że tlenek azotu może wiązać się zarówno z jonem żelaza na +II jak i +III stopniu utlenienia, oraz że w takich adduktach jon żelaza znajduje się w stanie niskospinowym. Przeprowadzone badania wykazały, że żadna z zastosowanych metod pojedynczo nie dostarcza pełnej informacji o połączeniach hemoglobiny z tlenkiem azotu, wobec czego niezbędne jest wykorzystanie kilku komplementarnych metod, aby lepiej zrozumieć mechanizmy oddziaływania tlenku azotu z hemoglobiną, które mogą mieć znaczenie fizjologiczne.The aim of the study was to investigate interaction between nitric oxide and isolated human erythrocytes, and in particular, to determine spin state and oxidation state of iron in haemoglobin-nitric oxide adduct by using biochemical and spectroscopic methods. Human blood was obtained from healthy volunteers and erythrocytes were isolated through gentle spinning. Nitric oxide was released from special NO donors: PAPA-NO, which slowly release NO (t1/2 = 15 minutes), and DEA-NO, which release NO much faster (t1/2 = 2 minutes). In this study the following methods were used: the blood gas analysis with the complete blood count, and three spectroscopic methods: resonance Raman spectroscopy, electron paramagnetic resonance spectroscopy, and UV-Vis absorption spectroscopy. Experiments showed, that reaction of nitric oxide with haemoglobin leads to formation of nitrosylhaemoglobin and nitrosylmethaemoglobin. This suggest, that iron ion in such adducts can be both on II and III oxidation state. In both cases iron ion is in low spin state. This work led to conclusion, that neither presented method alone did not provide full insight into nitric oxide-haemoglobin adducts, and the usage of few complementary methods is necessary, so as to better understand interaction of nitric oxide with haemoglobin, that could have physiological importance