The influence of environmental antiandrogens on expression of pro-and anti-apoptotic proteins in the porcine ovarian follicles - in vitro studies.

Podczas folikulogenezy w jajnikach ssaków dochodzi do atrezji bardzo dużej liczby pęcherzyków jajnikowych. Obecnie uważa się, że apoptoza komórek ziarnistych stanowi punkt wyjścia dla tego procesu.Bardzo ważną rolę w procesie folikulogenezy pełnią androgeny. Zapewniają one prawidłowy rozwój pęcherzyków, a także służą za substrat do syntezy estrogenów. Jednak po przekroczeniu pewnego poziomu mogą powodować apoptozę komórek ziarnistych, przyczyniając się do hamowania rozwoju pęcherzyków i ich atrezji.Celem tej pracy jest zbadanie wpływu antyandrogenów takich jak 2-hydroksyflutamid i winklozolina na ekspresję białek pro- i antyapoptotycznych w komórkach ziarnistych. Do hodowli (48h) użyto komórek ziarnistych pobranych ze świńskich pęcherzyków jajnikowych. Wstępna hodowla trwała 24h. Po tym czasie wymieniono medium hodowlane (z 10% płodową surowicą bydlęcą oraz AAS) a do hodowli dodano testosteron (T), 2-hydroksyflutamid (2-Hf), winklozolinę (Vnz) oraz kombinacje T + 2-Hf i T+Vnz. Po kolejnych 24h zebrano supernatant i komórki ziarniste, które posłużyły do badań ekspresji białek techniką mikromacierzy białkowych. Po izolacji białka, zostało ono użyte w reakcji wiązania z przeciwciałami na płytce do mikromacierzy. Reakcję wywołano przy udziale buforu do wywołania reakcji, a następnie odczytano w urządzeniu ChemiDoc. Pod wpływem 2-hydroksyflutamidu wykazano wzrost ekspresji białek charakterystycznych dla zewnętrznego szlaku apoptozy. Świadczy to o proapoptotycznym charakterze tego antyandrogenu. W połączeniu z testosteronem, 2-Hf wykazywał działanie antyapoptotyczne. Winklozolina nie wykazała natomiast proapoptotycznego działania w komórkach ziarnistych.During folliculogenesis the large majority of the follicles undergo aresia. Now, we know that apoptosis of granulosa cells is the starting point for the process. Androgens plays a very important role in folliculogenesis. They ensure the proper development of follicles, as well as they serve as a substrate for the synthesis of estrogens. However, above a certain level androgens can cause apoptosis of granulosa cells, thus inhibiting the development of follicles and then atresia.The aim of this study was to investigate influence of antiandrogens, such as 2-hydroxyflutamide and vinclozolin, on the expression of pro- and anti-apoptotic proteins in granulosa cells. Culture of granulosa cells isolated from porcine follicles lasted 48h. After 24-hour preculture, the culture medium (supplemented with 10% fetal bovine serum and AAS) was replaced and testosterone (T), 2-hydroxyflutamide (2-Hf), vinclozolin (Vnz), T+2-Hf and T+Vnz were added. After another 24h of culture, supernatant and granullosa cells were collected for further study. The method used in this study was Protein Microarrays. Isolated protein was used to bind with specific antibodies on microarray plate. Reaction was induced by using Detection Buffer. The results were read in ChemiDoc. Expression of proteins characteristic for the extrinsic apoptosis pathway increases under the effect of 2-hydroxyflutamide. That indicate a pro-apoptotic nature of 2-hydroxyflutamide. I combination with testosterone, 2-Hf showed an anti-apoptotic activity. In this study. Vinclozolin didn’t show an pro-apoptotic effect in granulosa cells