Research on biochemical and genetic characteristics of opportunistic pathogens belonging to Staphylococcus aureus, S. intermedius and S. pseudintermedius isolated from human and animal pathological changes.

Wśród bakterii należących do rodzaju Staphylococcus występują gatunki charakterystyczne dla mikroflory prawidłowej skóry oraz błon śluzowych człowieka, a także zwierząt. Skład fizjologicznej mikroflory jest bardzo zróżnicowany nie tylko w przypadku organizmów należących do odmiennych gatunków, ale także w odniesieniu do poszczególnych obszarów anatomicznych. Zaburzenia liczebności bądź składu gatunkowego fizjologicznej mikroflory skutkują rozwojem zakażenia. Jego rodzaj oraz lokalizacja zależne są od czynników determinujących zjadliwość danego szczepu, których synteza i uwalnianie jest wynikiem ekspresji określonych genów. Podobny wachlarz czynników wirulencji może wynikać nie tylko z wysokiego podobieństwa genomowego DNA, determinowanego przez wysoki współczynnik pokrewieństwa, ale również z modyfikacji zachodzących w genomie pod wpływem presji środowiska zewnętrznego.Celem realizowanego w niniejszej pracy projektu była identyfikacja oraz określenie pokrewieństwa 58 izolatów, należących do rodzaju Staphylococcus, pochodzących z różnych zmian chorobowych ludzi i zwierząt domowych. W pierwszej części projektu kolekcję drobnoustrojów poddano analizie fenotypowej. W tym celu wykonano testy w kierunku aktywności enzymów proteolitycznych, ureazy oraz amylazy, a także komercyjny test ID 32 STAPH, na podstawie którego określono przynależność gatunkową poszczególnych izolatów.W kolejnym, zasadniczym etapie badań przeprowadzono analizę genetyczną przy pomocy technik biologii molekularnej opartych na reakcji PCR. W oparciu o wyniki uzyskane metodami RAPD oraz TRIPLEX określono stopień podobieństwa genetycznego mający odzwierciedlenie w pokrewieństwie badanych izolatów.Na podstawie przeprowadzonych testów fenotypowych wykazano aktywność enzymów proteolitycznych, amylazy i ureazy u odpowiednio: 93%, 95% oraz 78% przebadanych izolatów, a także znacząco wyższą aktywność biochemiczną szczepów należących do gatunków S. intermedius oraz S. pseudintermedius w stosunku do przedstawicieli gatunku S. aureus. Spośród 55 przebadanych izolatów, na podstawie testu API 32 STAPH, 24 zaklasyfikowano do gatunku S. aureus, 28 do gatunku S. intermedius a 3 do gatunku S. hominis. Wyniki analizy genetycznej przeprowadzonej techniką RAPD, na podstawie których badana kolekcja drobnoustrojów została podzielona na stosunkowo dużą liczbę typów (15 typów na poziomie 75% podobieństwa genetycznego) o małej liczebności, można wnioskować o wysokiej heterogenności bakterii z rodzaju Staphylococcus. Analiza badanej kolekcji drobnoustrojów techniką TRIPLEX PCR potwierdziła obecność genu coa u 96% a genu spa u 93% badanych izolatów oraz wykluczyła obecność genu hvr u wszystkich przedstawicieli badanej kolekcji. Analiza podobieństwa genetycznego tą metodą wykazała stosunkowo wyższe pokrewieństwo badanych izolatów (10 typów na poziomie 75% podobieństwa genetycznego) niż pokrewieństwo wyznaczone przy pomocy techniki RAPD. Na podstawie otrzymanych wyników wykluczono klonalny charakter zakażeń w większości analizowanych przypadków. Potwierdzono natomiast występowanie zjawiska transmisji szczepów pomiędzy osobnikami należącymi do różnych gatunków. Zmiana żywiciela, indukująca pod wpływem presji środowiska zmiany w poziomie ekspresji niektórych genów mające swoje odzwierciedlenie w fenotypie komórki, może być przyczyną wykazanej w niniejszej pracy wysokiej heterogenności populacji gronkowców.Among bacteria belonging to the Staphylococci occurs species characteristic of normal physiological microflora of human’s and animal’s skin and mucous membranes. Composition of physiological microflora is highly diverse, not only in the case of organisms belongs to different species, but also in relation to specific anatomical parts of the body. Disorders on numbers or composition of physiological microflora are the causes of development of the infection. Type and localization of infection depends on factors which determine the virulence of a certain strain, which synthesis and release is the result of the expression of certain genes. Nearly the same range of virulence factors may be a result of high similarity of genomic DNA, determined by high coefficient of relationship, but also as a result of genome modifications occurring under the influence of environmental pressure. The aim of that project is identification and determination of relationship between 58 isolates, belonging to Staphylococci, taken from human and domestic animal various pathological changes. In the first part of this project bacteria, belonging to analyzed collection was subjected to phenotypic analyses. For that purpose tests were made to determine activity of proteases, amylase and urease. Additionally commercial test ID 32 STAPH was made for identification of testing isolates. In following, essential stage of these research genetic analyses by using techniques of molecular biology based on PCR reaction were made. On the grounds of this results, obtained by the following methods: RAPD and TRIPLEX, investigation evaluated degree of genetic similarities which was reflected in relationships of isolates. Based on phenotypic tests the activity of proteases, amylases and urease was show in the case of 93%, 95% and 78% of examined isolates respectively. Additionally significantly higher level of biochemical activity was shown in the case of isolates belonging to S. intermedius and S. pseudintermedius than in the case of S. aureus. From 55 tested isolates 24 of them was classified as S. aureus, 28 as S. intermedius and 3 isolates as S. hominis using the API 32 STAPH test. Results of genetic analysis done by RAPD technique led to division of isolates from analyzed collection into a large number of small size types (15 types on the level of 75% of genetic similarity) and based on that results high heterogeneity of Staphylococci strains can be noticeable. Analyse of tested isolates by TRIPLEX PCR technique confirmed the presence of coa gene in 96%, spa gene in 93% of all isolates whereas the presence of hvr gene in all isolates was excluded. Analyse of genetic similarity by this method was shown relatively higher relationship between tested isolates (10 types on the level of 75% of genetic similarity) than in the case of relationship determined by RAPD technique.Based on obtained results the risks of clonal infections was excluded in the majority of analyzed cases, however occurrence of transmission between organisms belonging to different species was confirmed. Change of the host induce, under the influence of environmental pressure, changes the level of expression of some genes, which have an impact on phenotype of the cell and could be the reason of high heterogeneity of Staphylococci strains