Dimethylaminoethanol exposure effects on the human neuroblastoma cells viability in the in vitro model

Dimetyloaminoetanol to związek organiczny należący do aminoalkoholi, powszechnie stosowany jako składnik preparatów kosmetycznych a uprzednio stosowany także jako lek nootropowy. Dane literaturowe wskazują, że zwiększa on stężenie choliny we krwi, głównie przez zahamowanie jej metabolizmu w tkankach obwodowych oraz podnosi poziom acetylocholiny - jednego z podstawowych neuroprzekaźników w układzie nerwowym. Opisano także antyoksydacyjne właściwości deanolu i zdolność do hamowania powstawania lipofuscyn (markerów starzenia). Z drugiej jednak strony, wyniki niektórych badań prowadzonych na zwierzętach doświadczalnych oraz w modelach in vitro wskazują na możliwość toksycznego działanie DMAE. Badając wpływ DMAE na żywotność fibroblastów i keratynocytów ludzkich wykazano jego właściwości cytotoksyczne.Dotychczas nie badano wpływu tego związku na komórki centralnego systemu nerwowego. Wiadomo, że deanol jako związek lipofilny ma zdolność do przekroczenia bariery krew- mózg i przechodzenia do tkanki mózgowej. Brak danych o działaniu tego związku na tkankę mózgową skłonił mnie do podjęcia badań, których celem było określenie wpływu deanolu na żywotność ludzkich komórek nerwowych w modelu in vitro. Doświadczenia prowadzono w komórkach neuroblastomy ludzkiej, komórkach linii SH-SY5Y. Komórki poddawano działaniu DMAE w zakresie stężeń od 0,1 do 1000 µg/ml przez 1, 3 i 5 dni. Aby określić stopień toksyczności związku oznaczono aktywność dehydrogenazy mleczanowej- markera uszkodzenia komórek na drodze nekrozy, żywotność komórek testem redukcji MTT i aktywność kaspazy-3 jako enzymu wykonawczego w procesie apoptozy.Wykazano, że DMAE powodował nekrozę komórek (obserwowaną jako wzrost aktywności dehydrogenazy mleczanowej) w przypadku 1-dniowej hodowli komórek ze związkiem w stężeniu 500 i 1000 µg/ml, a w hodowli 3-dniowej już w stężeniu 200 µg/ml. Analogicznie jak w przypadku indukcji nekrozy, deanol działając w tym samym czasie i z zastosowaniem tych samych stężeń obniżał żywotność komórek. W obu testach wydłużenie czasu hodowli do 5 dni nie nasiliło zmian, a w teście redukcji MTT wykazano zwiększoną żywotność komórek po zastosowaniu niskich stężeń DMAE. Zależność efektu cytotoksycznego od czasu działania sugeruje możliwość występowania tolerancji na nekrotyczne działanie DMAE. Stwierdzono także, że DMAE w stężeniach od 0,1 do 200 µg/ml obecny w pożywce hodowlanej przez 3 dni nie zwiększał aktywności kaspazy-3 a najniższe z badanych stężeń (0,1 µg/ml) nawet obniżało aktywność tego enzymu. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że DMAE w wysokich stężeniach obecny w pożywce hodowlanej przez krótki czas indukuje proces nekrozy komórek SH-SY5Y. Przy niskich stężeniach badanego związku i przedłużeniu czasu hodowli do 5 dni obserwowano natomiast ochronne działanie DMAE. Ze względu na brak danych dotyczących stężenia DMAE w tkance mózgowej po jego podaniu doustnym czy aplikacji na skórę nie można rozstrzygnąć, czy stężenia wywołujące działanie cytotoksyczne w moim doświadczeniu, w modelu in vitro, mogą być osiągane w warunkach in vivo. Wydaje się, że neurotoksyczny efekt DMAE w warunkach in vivo jest mało prawdopodobny, ale dopiero określenie długotrwałego narażenia na ten związek w warunkach in vivo pozwoli na wykluczenie jego neurodegeneracyjnego działania.Dimethylaminoethanol is a compound which belongs to amino alcohols and is used as a constituent of cosmetics as well as a nootropic drug. The data suggests that the DMAE increases concentration of choline in blood, particularly due to inhibiting its metabolism in tissues, and increases the level of acetylcholine - one of the neurotransmitters in central nervous system. In addition to that, the anti-oxidative properties of deanol and ability to inhibits the formation of lipofuscin (ageing pigment) were also described. On the other hand, the results of animal and in vitro studies indicate the possibility of toxic effects of DMAE. Studying the influence of deanol on human fibroblasts and cutaneous epithelial cells, it was proved that DMAE has cytotoxic properties. The influence of the compound on central nervous system cells still has not been examined. Deanol, as a lipophilic compound, has the ability to exceed the blood-brain barrier and pass into brain tissue. Lack of data concerning the impact of DMAE on brain tissue enhanced me to undertake the research aiming at the analysis of deanol exposure effects on human nerve cells viability in the in vitro model.The experiments were conducted on human neuroblastoma cells (SH-SY5Y cell line). The cells were subjected to the DMAE in concentration over the range of 0,1-1000 µg/ml for 1, 3 and 5 days. In order to determine the level of the compound toxicity, the activity of lactate dehydrogenase (the indicator of cells damage due to necrosis), cells viability (MTT assay) and the activity of caspase-3 (one of the critical enzymes of apoptosis) were determined. It was proved that DMAE caused cell necrosis (which was observed as the increase of the activity of lactate dehydrogenase) in the case of one day cell culture along in the 500 and 1000 µg/ml DMAE concentration, as well as in the case of 3-day culture in 200 µg/ml. Analogically to the induction of necrosis, deanol, which was active within the same period of time and in the same concentration range, reduced the viability of the cells. In both cases, prolongation of the time up to 5 days did not intensify the changes, and the MTT assay signified the increase of cells viability in low concentration of DMAE. The impact of the process duration on the cytotoxic effect suggests that there could be a cells tolerance for necrotic activity of DMAE. It was also showed that DMAE kept for 3 days in the concentration within the range of 0,1 do 200 µg/ml in the culture medium do not increased the activity of capsase-3. The experiments suggest that DMAE highly concentrated in the culture medium for a short period of time induces the process of SH-SY5Y cells necrosis, whereas the lower concentration of these compound and prolongation of time up to 5 days induces the protective effect of DMAE. Due to the lack of data concerning the concentration of DMAE in brain tissue after either oral or external application it is impossible to prove whether the concentrations of these compound and the inducement of cytotoxic activity in in vitro experiments are attainable in the in vivo. It appears that the neurotoxic effect of DMAE in vivo is not feasible. Only after determining long-term exposure to DMAE in in vitro will help to exclude its neurodegenerative effect