Generation of diagnostic monoclonal antibodies recognizing Antigen A of ABO blood group system

Celem projektu było otrzymanie diagnostycznych przeciwciał monoklonalnych do oznaczania antygenu A z układu ABO. Wykonano 7 fuzji komórek szpiczaka mysiego z komórkami B pochodzącymi ze śledziony myszy immunizowanej krwinkami grupy krwi A układu ABO. Otrzymane klony testowano pod kątem produkcji przeciwciał specyficznie aglutynujących ludzkie krwinki wykazujące ekspesję antygenu A. Przeprowadzono klonowanie i subklonowanie wybranych klonów hybrydoma wraz z izotypowaniem wykonanym metodą ELISA potwierdzając, że produkowane przeciwciała są klasy IgM. W celu uzyskania preparatu o wysokim stężeniu przeciwciał monoklonalnych, przeprowadzono hodowlę wybranych klonów komórek hybrydoma na dużą skalę w laboratoryjnym bioreaktorze. Metodą western blotting oznaczono poziom przeciwciał w otrzymanym preparacie. Oceniono przydatność przeciwciał do celów diagnostycznych przeprowadzając odpowiednie testy aglutynacji. Określono miano przeciwciał w uzyskanym preparacie i ich zachłanność. Przygotowano próbki do sekwencjonowania i przeanalizowano uzyskane sekwencje nukleotydowe łańcucha ciężkiego przeciwciał IgM, przy użyciu bazy danych IMGT określając, które fragmenty kodują istotne regiony przeciwciała. Spośród przeciwciał wybrano dwa, o największej zachłanności i specyficzności aglutynacji, które wysłano w celu oceny do Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Jedno z przeciwciał zostało już zatwierdzone do celów diagnostycznych.In order to produce hybridoma cell lines able to synthesize monoclonal antibodies specific to antigen A of ABO blood-group system seven cell fusions were performed. Spleen cells isolated from mice immunized with red blood cells of group A were fused with mouse myeloma cells. After selection, media from hybridoma cultures were tested for the presence of anti-A agglutinating antibodies. Hybridoma cultures, able to produce specific monoclonal antibodies were cloned and subcloned. The IgM isotype of produced antibodies was confirmed by ELISA. In order to obtain a preparation containing antibodies at high concentration, hybridoma cells were cultured in a laboratory bioreactor. Western blotting was used to analyze the quality of produced antibodies. The cDNA coding for a heavy chain of obtained immunoglobulins had been sequenced and analyzed using IMGT on-line database. To analyse the usefulness of selected antibodies for diagnostic purposes several agglutination tests were performed. The best two antibodies, with the highest avidity and absolute specificity were chosen to be evaluated by the Warsaw Institute of Hematology and Transfusiology. One of them had been approved for a diagnostic use