Effects of orexin A on electrophysiologically and neurochemically characterized neurons of the rat nucleus incertus

Jądro niepewne (NI) to grupa neuronów GABAergicznych w pniu mózgu. Jest głównym źródłem nowoodkrytego peptydu – relaksyny-3 (RLN3). Badania potwierdziły udział NI i RLN3 w kontroli apetytu, modulacji wzbudzenia i odpowiedzi stresowej, jak również kontroli hipokampalnego rytmu theta. Wymienione funkcje pokrywają się z funkcjami oreksyn, neuropeptydów syntetyzowanych przez neurony bocznego i przysklepieniowego podwzgórza, unerwiających wiele obszarów mózgowia, w tym pień mózgu. Natywnymi receptorami dla oreksyn są sprzężone z białkiem G receptory OX1R oraz OX2R, których aktywacja z reguły prowadzi do depolaryzacji błony komórkowej poprzez szereg mechanizmów, w tym poprzez zwiększenie błonowych prądów wapniowych.Niniejsza praca jest próbą scharakteryzowania aktywności neuronów jądra niepewnego oraz weryfikacji efektu działania oreksyny A na te komórki. Wykonano rejestracje whole-cell patch clamp oraz barwienia immunohistochemiczne na obecność relaksyny-3 w neuronach NI na skrawkach mózgu szczura. W celu obiektywnego zbadania populacji neuronów NI bez założeń a priori dotyczących grup posłużono się analizą klastrów. Wyłonione trzy podgrupy komórek różniły się szeregiem właściwości elektrofizjologicznych, co bezpośrednio przekładało się na ich wzorzec aktywności. Najwięcej neuronów należało do klastra II i charakteryzowało się najwyższą regularnością i częstotliwością wyładowań. Neurony klastra I wykazywały się najmniejszą regularnością wyładowań oraz pośrednią częstotliwością. Klaster III stanowiły neurony o najniższej częstotliwości i pośredniej regularności wyładowań. Występowały również różnice w proporcjonalnej ilości komórek RLN3-immunoreaktywnych w poszczególnych klastrach.W celu zbadania wpływu oreksyny A (OXA) na komórki NI wykonano rejestracje w obecności tetrodotoksyny (TTX) oraz blokera kanałów wapniowych – chlorku niklu (II). Wykazano, że depolaryzujący efekt OXA na komórki NI był niwelowany w obecności niklu, co wskazuje na zależny od jonów wapnia mechanizm aktywacji receptorów oreksynowych w NI. Wyniki te przyczyniają się do rosnącej wiedzy o neuronach jądra niepewnego oraz pozwalają na lepsze zrozumienie natury interakcji dwóch systemów peptydów – oreksyn i relaksyny-3. Dalsze badania pozwolą na wyjaśnienie udziału NI i systemu relaksyny-3 w neurofizjologicznych mechanizmach związanych z pobieraniem pokarmu, wzbudzeniem i pamięcią przestrzenną.The nucleus incertus (NI) is a group of GABAergic neurons located in the brainstem. It is the main source of a newly discovered peptide - relaxin-3 (RLN3). Research indicated the involvement of the NI relaxin-3 system in appetite control, modulation of arousal and stress responses, as well as regulation of the hippocampal theta rhythm. These functions are similar to the ones of orexins - neuropeptides synthesized by neurons of the lateral and perifornical hypothalamus. Orexin neurons innervate many brain regions, including the brainstem, and activate native receptors OX1R and OX2R, which most often leads to cell membrane depolarization through a number of possible mechanisms, including increases in the membrane calcium current.This research is an attempt to characterize the activity of NI neurons, as well as to verify the effects of orexin A on these cells. Whole-cell patch clamp recordings were performed on rat brain slices, along with immunohistochemical staining for the presence of relaxin-3 in NI neurons. Cluster analysis was performed to ensure objective examination of neuronal populations without a priori assumptions regarding groups. Three clusters were revealed, differing in various electrophysiological properties, which translated directly to distinct patterns of activity. Cluster II neurons were the largest population, characterized by the highest regularity and frequency of firing. Cells belonging to cluster I were the least regular and of medium frequency. Cluster III contained cells with medium regularity of firing and lowest frequency. The differences between clusters were also visible in the relative distribution of cells immunoreactive for RLN3.In order to examine the effects of orexin A on NI neurons, recordings were made using tetrodotoxin (TTX) and the calcium channel blocker nickel (II) chloride. The depolarizing effect of orexin A on NI neurons was abolished in the presence of nickel chloride, which suggests a calcium-dependent mechanism of orexin receptor activation in the NI. These results contribute to the expanding knowledge about NI neurons and allow for better understanding of the nature of interactions between the two peptide systems. Further research will help clarify the NI/RLN3 involvement in neurophysiological mechanisms connected with feeding, arousal and spatial memory