Production of lentiviral vectors for overexpression of heme oxygenase-1 in hematopoietic stem cells

Niniejsza praca prezentuje metodę konstrukcji wektorów lentiwirusowych z sekwencjami oksygenazy hemowej aktywnej enzymatycznie (HO-1 WT) oraz nieaktywnej enzymatycznie (H25A). W formie H25A histydyna w pozycji 25, która jest kluczowa dla wiązania hemu, została zamieniona na alaninę. Forma aktywna enzymatycznie przeprowadza reakcję degradacji hemu, w wyniku której powstają czynniki o dowiedzionych właściwościach antyoksydacyjnych, antyapoptotycznych, przeciwzapalnych i proangiogennych. Co więcej, ostatnie badania potwierdzają, że HO-1 może działać także poprzez mechanizmy pozaenzymatyczne, regulując transkrypcję i ekspresję genów.Aby skonstruować wspomniane wektory lentiwirusowe, użyto sekwencji HO-1 WT i HO-1 H25A wklonowanych do plazmidu pEFneo. Ich analiza bioinformatyczna pozwoliła na wykrycie delecji w pozycji 898. W celu naprawy mutacji przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) z primerami zawierającymi dodatkowo miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych. Prawidłowe sekwencje wklonowano do wektorów lentiwirusowych (LeGO-iG2). Skonstruowane wektory lentiwirusowe zostały następnie użyte do transdukcji komórek HEK293T. Efektywność transdukcji została sprawdzona zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Dodatkowo wykonano również doświadczenia mające na celu zbadanie lokalizacji HO-1 w komórce, która, jak obecnie wiadomo, ma związek również z odgrywaną przez HO-1 funkcją. Następnie, uzyskane wektory zostały wykorzystane do wywołania nadekspresji HO-1 w hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC). Wykorzystując cytometrię przepływową wykazano obecność transdukowanych komórek HSC. Wykonano również eksperyment mający na celu ocenę wpływu HO-1 na formowanie kolonii hematopoetycznych. Nie zaobserwowano jednak ich wzrostu przy zastosowanym protokole transdukcji i sortowania. Podsumowując, zastosowana strategia klonowania umożliwiła konstrukcję wektorów lentiwirusowych pozwalających na uzyskanie nadekspresji aktywnej oraz nieaktywnej enzymatycznie HO-1. Jednakże, konieczne są dodatkowe badania, które mogłyby potwierdzić aktywność powstałych białek. Uzyskane wyniki wskazują, że skonstruowane wektory mogą transdukować komórki HSC.Present study shows the method of construction of lentiviral vectors with sequences of enzymatically active (HO-1 WT) and inactive (HO-1 H25A) heme oxygenase. In HO-1 H25A form the histidine residue at position 25, that is crucial for heme binding, was replaced by alanine. Enzymatically active form carries out a reaction of heme degradation, which results in production of factors with proven anti-oxidative, anti-apoptotic, anti-inflammatory, pro-angiogenic properties. What is more, recent studies confirm that HO-1 can also act through non-enzymatic mechanisms, regulating genes’ transcription and expression.In order to construct mentioned vectors, the sequences of HO-1 WT and HO-1 H25A from pEFneo plasmid were used. Bioinformatical analysis of these sequences revealed a deletion at position 898. Because of this, polymerase chain reaction (PCR) with overhanging primers was conducted to correct the mutation. After that, the sequences were cloned into lentiviral plasmids (LeGO-iG2).Constructed lentiviral vectors were then used for transduction of HEK293T cells. The efficacy of transduction was checked on both mRNA and protein level. Additionally, the experiments aiming at studying the localization of HO-1 in the cell were conducted. Its localization, as known now, is connected with its function.Next, obtained vectors were used to induce overexpression of HO-1 in hematopoietic stem cells (HSC). Using flow cytometry, the presence of transduced HSC was indicated. The experiment which purpose was to evaluate the influence of HO-1 on hematopoietic colonies forming was conducted. However, their growth was not confirmed.In summary, used cloning strategy allowed for construction of lentiviral vectors which were able to induce overexpression of enzymatically active and inactive forms of HO-1. However, further studies are necessary to confirm the activity of the expressed proteins. Obtained results indicate that these vectors can transduce HSCs