Effect of low protein diet on the level of mRNA for the selected components of Branched-Chain α-Ketoacid Dehydrogenase complex in rat adipose tissue

Kompleks dehydrogenazy rozgałęzionych α-ketokwasów (BCKDH) jest enzymem katalizującym kluczowy etap katabolizmu aminokwasów rozgałęzionych (BCAA). Egzogenne BCAA są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu, jednak ich ilość musi być ściśle kontrolowana, w nadmiarze bowiem mają działanie toksyczne. Regulacja poziomu BCAA zachodzi poprzez zmianę aktywności kompleksu BCKDH. Najistotniejszym mechanizmem regulującym aktywność BCKDH jest modyfikacja kowalencyjna. Za fosforylację, i tym samym inaktywację kompleksu BCKDH odpowiada specyficzna kinaza (BDK), natomiast za defosforylację i aktywację – specyficzna fosfataza (BDP). Jednym z czynników modyfikujących aktywność kompleksu BCKDH jest podaż białka pokarmowego. Wpływa ona na zmiany ilości mRNA i białek kinazy BDK oraz podjednostek E1α, E1β i E2 kompleksu BCKDH. Przy zastosowaniu diety niskobiałkowej następuje zwiększenie ekspresji BDK co prowadzi do wzrostu stopnia ufosforylowania BCKDH i tym samym spadku aktywności kompleksu. Skutkuje to zahamowaniem katabolizmu BCAA i zachowaniem tych aminokwasów do syntezy białek. Regulacja aktywności fosfatazy BDP wciąż nie jest poznana. Można przypuszczać jednak, że dieta niskobiałkowa ma wpływ na ekspresję tego enzymu. Celem pracy było zbadanie wpływu diety niskobiałkowej (8% białka) na poziom mRNA dla BDP w tkance tłuszczowej szczurów. Jako materiał biologiczny do badań wykorzystano tkankę tłuszczową szczurów płci męskiej, rasy Wistar. Przez okres 14 dni zwierzęta z grupy badanej karmiono paszą niskobiałkową (8%), natomiast zwierzęta z grupy kontrolnej żywiono paszą standardową, o zawartości białka 23%. Z tkanki tłuszczowej wyizolowano RNA i przeprowadzono reakcję RT-PCR, a uzyskane produkty poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu agarozowym. Odczytano wartości gęstości densytometrycznej uzyskanych prążków po czym wyniki poddano analizie statystycznej. Jako gen referencyjny zastosowano β-aktynę. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono występowanie mRNA dla fosfatazy kompleksu BCKDH w tkance tłuszczowej szczurów obu grup. Średnia znormalizowana gęstość densytometryczna opowiadająca poziomowi mRNA była o około 4% wyższa w grupie zwierząt karmionych paszą niskobiałkową niż w grupie kontrolnej, żywionej paszą standardową (0,51 ± 0,02 vs 0,49 ± 0,06). Nie stwierdzono zatem znamiennej statystycznie różnicy pomiędzy grupami (p>0,05). Uzyskane wyniki sugerują, że w tkance tłuszczowej szczura dieta niskobiałkowa (8%) nie powoduje zmiany poziomu mRNA dla BDP. Jednak na podstawie powyższych badań nie można jednoznacznie stwierdzić, czy ograniczona podaż białka nie wpływa na aktywność fosfatazy BDP. Dla lepszego poznania wpływu diety niskobiałkowej konieczne są dalsze badania, obejmujące m.in. analizę wpływu tej diety na aktywność fosfatazy BDP oraz kompleksu BCKDH w tkance tłuszczowej.Branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex (BCKDH) is a key enzyme of the catabolism of branched-chain amino acids (BCAA). Exogenous BCAA exert different functions in the body. However the amount of BCAA must be precisely controlled because their excess is toxic. Regulation of BCAAs concentrations occurs at the level of their degradation by changing the activity of the BCKDH complex. The most important mechanism of regulating BCKDH activity is covalent modification. Phosphorylation and inactivation of BCKDH is catalyzed by a specific kinase (BDK) whereas dephosphorylation and activation of complex require the action of specific phosphatase (BDP).One of the factors that modify the activity of the BCKDH complex is dietary protein availability. It affects the amount of mRNA and protein of BDK kinase as well as catalytic subunits E1α, E1β and E2 of BCKDH complex. A low protein diet increases the expression of BDK which leads to an increase in phosphorylation BCKDH and thereby decreases BCKDH complex activity. This results in inhibition of the BCAA catabolism and spares these amino acids for protein synthesis. Regulation of BDP activity has not been described. It can be assumed that low protein diet affect the expression of BDP.The aim of this study was to investigate the effect of low protein diet (8% protein) on the mRNA level for the BDP in rat adipose tissue. For 14 days the animals in the study group were fed a low protein feed (protein content 8%) or a standard feed (protein content 23% – control group). RNA was isolated from adipose tissue and mRNA level was analyzed by RT-PCR. Obtained products were separated by agarose gel electrophoresis. Average density values of formed bands were read and analyzed statistically (after normalization for β-actin).The presence of mRNA for BCKDH phosphatase in rat adipose tissue of both groups was demonstrated. In adipose tissue of animals fed low protein diet mRNA level for BDP was about 4% higher than in control group (0,51 ± 0,02 vs 0,49 ± 0,06). Therefore there was no statistically significant difference between the groups (p>0, 05). These results suggest that limited supply of dietary protein (8%) do not affect mRNA level for BDP in rat adipose tissue. However, the impact of low protein diet on the BDP activity and consequently on the BCKDH activity cannot be excluded. Further studies are necessary to evaluate this effect