Utilization of flow cytomtery and nanoparticle tracking analysis for extracellular vesicles detection

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (ang. extracellular vesicles, EV) to nazwa niewielkich, na ogół kulistych struktur, wydzielanych do płynów ustrojowych przez niemal wszystkie komórki organizmu. Uważane są one za nowy rodzaj mediatorów, mogących przenosić między komórkami określone białka, mRNA i miRNA. Ładunek ten („cargo”) może wpływać na wiele ważnych procesów komórkowych, jak np. prezentacja antygenów, immunosupresja, apoptoza.Spośród kilku typów EV, egzosomy i mikropęcherzyki, tzw. ektosomy cieszą się największym zainteresowaniem badaczy ze względu na ich potencjalne znaczenie w diagnostyce klinicznej. Zwiększony poziom egzosomów i ektosomów obserwuje się w przewlekłych stanach chorobowych, takich jak nowotwory czy choroby układu krążenia. Korelacja liczby specyficznych EV ze stanem chorobowym może być ważnym krokiem w poprawie diagnostyki i oceny rokowań dla pacjenta.Potencjalne wykorzystanie EV w diagnostyce klinicznej zależy od tego czy możliwa będzie szybka ocena ich poziomu oraz ich charakterystyka morfologiczno-fenotypowa w badanym materiale biologicznym, takim jak np. osocze krwi czy mocz. Obecnie najczęściej wykorzystywaną metodą do analizy EV jest cytometria przepływowa. Alternatywą dla cytometrii przepływowej w badaniach EV, zwłaszcza egzosomów, wydaje się być metoda analizy trajektorii nanocząstek (ang. nanoparticle tracking analisys, NTA). Metoda ta pozwala na określenie rozkładu wielkości i stężenia EV o średnicy od 30 nm.W pracy skupiono się na porównaniu metody cytometrii przepływowej oraz NTA w badaniach stężenia, fenotypu i wielkości EV izolowanych z osocza krwi chorych na raka jelita grubego, zdrowych dawców krwi oraz pozyskanych z nadsączy hodowli komórek linii nowotworowych raka jelita grubego (RJG).Uzyskane wyniki potwierdzają możliwość wykorzystania techniki NTA do szybkiego oznaczania stężenia i rozkładu wielkości EV. Pomimo niskiej czułości detekcji fluorescencji, dzięki zastosowaniu odpowiedniego systemu wzmocnienia sygnału, metoda ta może być również wykorzystana do oceny fenotypu badanych EV, zwłaszcza egzosomów. Metoda cytometrii przepływowej jest natomiast znacznie bardziej czuła w badaniach fluorescencji. Jej poważnym ograniczeniem jest jednak próg detekcji, pozwalający analizować jedynie cząstki większe niż 200 nm. W przypadku egzosomów, konieczne jest więc ich opłaszczenie na większym nośniku (kulkach lateksowych), co dopiero umożliwia ich dalszą analizę cytometryczną.Podsumowując, metody cytometrii przepływowej i NTA pomimo istotnych ograniczeń, wzajemnie się uzupełniają i stosowane razem mogą dostarczyć pełniejszej charakterystyki morfologiczno-fenotypowej EV.Extracellular vesicles (EV) is the name of the group of small, usually spherical, structures, secreted to body fluids by almost every cell of the organism. They are considered as a new class of mediators, capable of convoying specified proteins, mRNAs and miRNAs between cells. Their cargo may alter many important processes, for instance antigen presentation, immunosupresion or apoptosis.Among different types of EV, exosomes and microvesicles (known also as ectosomes) gained the biggest attention from scientists, because of their potential role in diagnostics. Increased levels of exosomes and ectosomes are observed in chronic diseases, e.g. cancers or cardiovascular diseases. Correlation between the numbers of specific vesicles and stadium of disease may be an important step in direction to improve diagnostics and patient’s prognosis.Potential utilization of EV in diagnostics depends on fast determination of their concentration and their morphological and phenotypical characterization in analyzed biological material, e.g. urine or blood plasma. Flow cytometry is at present a method of choice in EV analysis. However, nanoparticle tracking analysis (NTA) could be considered as an alternative for flow cytometry in the field of EV analysis, especially in exosome studies. This method is capable of determining concentration and size distribution of vesicles that are bigger than 30 nm.This thesis consist comparison of flow cytometry and NTA in determining concentration, phenotype and size distribution extracellular vesicles that were isolated form blood plasma of colorectal cancer patients, healthy donors and supernatants from colorectal cancer cell cultures.Obtained results are proving ability of NTA utilization for fast determination of concentration and size distribution of EV. Despite a low fluorescence sensitivity, utilization of adequate system for fluorescence amplification, allows this method to be exploited for phenotypical characterization of EV, especially exosomes. Flow cytometry is, however more sensitive in terms of fluorescence detection. Its disadvantage is a detection limit, which allows only particles of 200 nm in size or higher to be analyzed. In case of exosomes, to allow their further analysis, it is necessary to coat them on a bigger carrier, e.g. latex beads.Summarize, methods of flow cytometry and NTA, despite their limitations, complements each other and can be utilize together to deliver better morpholofical and phenotypical characteristic of EV