Application of silver nanoparticles for determination of low-molecular thiols in biological material. Synthesis of nanoparticles.

Nanocząsteczki są to substancje, zarówno organiczne jak i nieorganiczne mające rozmiary mniejsze niż 100 nm przynajmniej w jednym wymiarze. Ich zastosowanie diagnostyczne wynika głównie z ich własności optycznych i zdolności zmiany widma powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR).Niskocząsteczkowe związki takie jak glutation, cysteina, homocysteina, cysteinyloglicyna, ergotioneina, kwas liponowy i koenzym A należą do związków tiolowych i pełnią istotną rolę w procesach biochemicznych. Tiole mogą występować w osoczu jako wolne i związane z białkami, a także jako zredukowane i utlenione. Tiole osocza najczęściej występują w postaci związanej z białkami. Zmiany w steżeniu poszczególnych tioli w osoczu ludzkim obserwuje się w różnych stanach patologicznych. W niniejszej pracy podjęto próbę opracowania metody oznaczania tioli drobnocząsteczkowych opartą o technologię nanocząsteczek. Metoda składała się z 6 etapów:1) Redukcja białek osocza TCEP’em. Użycie TCEP’u jako czynnika redukującego pozwoliło uwolnić sprzężone z białkami tiole drobnocząsteczkowe do postaci wolnej.2) Wytrącanie białek acetonitrylem (ACN). Właściwe dobranie odczynnika, jakim jest acetonitryl, pozwoliło na precypitację białka.3) Dodanie nanocząsteczek srebra opłaszczonych detergentem stabilizującym.4) Usunięcie niezwiązanych z nanocząsteczkami srebra amin, poprzez przepłukanie próbki roztworem cytrynianu sodu, a następnie odwirowanie.5) Derywatyzacja zaadsorbowanych na powierzchni nanocząsteczek aminotioli dinitrofluorobenzenem (DNFB). Selektywnemu procesowi derywatyzacji podlegały tylko aminotiole zaadsorbowane na nanocząsteczkach srebra. Inne związki zawierające grupę aminową były usuwane w trakcie procedury płukania.6) Kompetycyjna desorbcja zderywatyzowanych aminotioli przy użyciu niewielkiej objętości roztworu ditiotreitolu (DTT). Dodanie ditiotreitolu (DTT) spowodowało usunięcie tioli z powierzchni nanocząsteczek. Uzyskana w ten sposób próbka zawierająca wolne tiole (ze sprzężoną z grupą aminową cząsteczką chromoforu) była analizowana metodą elektroforezy kapilarnej.Dzięki zastosowanej procedurze udało się uzyskać znaczne zwiększenie czułości, gdyż wychwycone na nanocząsteczkach tiole były zagęszczone poprzez wirowanie (objętość roztworu została w porównaniu z całkowitą objętością użytych odczynników zmniejszona 280 razy) i specyficzności, gdyż inne związki aminowe były usuwane ze środowiska reakcji.Nanoparticles are defined as any material that is smaller than 100 nm in at least one of its dimensions. Noble metals nanoparticles possess unique spectral properties described as plazmon surface resonance. That unique property is used in diagnostics.Low-molecule compounds as glutathione, cysteine, homocysteine, cysteinylglycine, ergothioneine, lipoic acid, coenzyme A belong to thiols and they play important role in many biochemical processes. Thiols can appear in plasma as free or bound with proteins and also oxidized and reduced. In human plasma most thiols are present in protein-bound form. Changes in concentrations of thiols in plasma are observed in some pathological conditions.In this work we tried to elaborate method for determination of main thiols in human plasma using nanoparticles technology. Methods consists of 6 steps:1) Reduction plasma proteins using TCEP. TCEP as reductant agent liberates protein-bound thiols to their free form.2) Protein elimination using acetonitrile (ACN). Acetonitrile precipitates proteins from the sample and does not destroy the stability of silver colloid (achieved by use of nonionic detergent).3) Binding of free thiols by addition of silver nanoparticles.4) Elimination of non-connected with nanoparticles amines, by washing the sample using trisodium citrate solution and centrifugation.5) Derivatization of thiols absorbed on nanoparticles surface by dinitrofluorobenzene (DNFB) reacting with aminogroups of thiols adsorbed on silver nanoparticles.6) Desorption derivatizated aminothiols by small volumes of dithiothreitol solution (DTT). DTT liberates all aminothiols from surface of nanoparticles. Obtained sample with free aminogroup derivatized thiols were ready for application to capillary electrophoresis system.Thanks to nanoparticles based procedure we increased sensitivity of the method, because thiols on nanoparticles can be concentrate by centrifugation (total sample volume was minimized 280 times as compared to total volume of all reagents), and specificity, because others non thiol compounds with amine group were eliminated from the reaction environment