The effect of cell cycle inhibitors on morphology of meiotic spindle in mouse oocytes.

Degradacja białek przeprowadzana w szlaku ubikwitynozależnej proteolizy (UPP) ma istotne znaczenie w przebiegu cyklu komórkowego. W niniejszej pracy wykazano istotny wpływ proteolizy na dojrzewanie mejotyczne oraz formowanie wrzeciona podziałowego w oocytach myszy przy zastosowaniu inhibitora proteasomu MG132 w stężeniu 20μM. Oocyty hodowano w obecności inhibitora w różnych wariantach czasowych a następnie wrzeciono podziałowe barwiono metodą immunofluorescencji przeciwciałami przeciwko α- tubulinie i określano jego morfologię. Dodatkowo obserwowano konformację chromatyny po wcześniejszym wybarwieniu z użyciem DAPI. W większości oocytów hodowanych w obecności inhibitora występuje nieuporządkowana sieć mikrotubul lub w ogóle brak jest specyficznego sygnału FITC, a chromosomy zatracają swoją prawidłową morfologię. Mają tendencję do zlewania się w owalne klumpy chromatynowe. Oocyty hodowane 6 godzin w standardowym medium M2 a następnie przeniesione do pożywki z inhibitorem zostały zatrzymane w metafazie I podziału mejotycznego. Wykształcone w nich wrzeciono podziałowe było dłuższe (średnio o 5,92μm) oraz szersze (średnio o 5,64μm) w odniesieniu do kontroli, a chromosomy w większości przypadków były rozproszone. Uzyskane wyniki świadczą o istotnej roli proteolizy w trakcie dojrzewania mejotycznego oraz formowania wrzeciona podziałowego, jednakże poznanie dokładnych mechanizmów molekularnych kierujących tymi procesami wymaga dalszych badań.Protein degradation in ubiquitin proteolysis pathway (UPP) is very important in regulation of cell cycle. In this study I show significant influence of proteolysis on oocyte maturation and spindle assembly using 20μM MG132 as specific inhibitor of proteasom. Oocytes were cultured in the presence of inhibitor in different time variants, spindles were immunofluorescence stained using anti α- tubulin antibodies with FITC and then the morphology of spindles were observed using fluorescent microscopy. Additionally, chromatin conformation was observed by staining with DAPI. In most of oocytes cultured in presence of inhibitor there were disordered microtubule structures or no spindles were observed and chromosomes lost their correct morphology. They have tendency to create oval structures named chromatin clumps. Oocytes cultured for 6 hours in standard medium M2 and then transferred to medium with inhibitor were stopped in metaphase I of first meiotic division. Spindles which were formed in this group of oocytes were longer (on average 5,92 μm) and wider (on average 5,64 μm) in relation to control group and chromosomes were dispersed in most of oocytes. The results obtained testify that proteolysis plays an important role in oocytes maturation and spindle assembly, however, understanding accurate mechanism of molecular regulation of that process need more research and study