Investigations on the effect of two-positive ions on the proteolytic activity of karilysin - metallopeptidase from Tannerella forsythia

Paradontoza jest chroniczną chorobą zapalną, która charakteryzuje się postępującą destrukcją tkanki łącznej wspierającej zęby. Głównym czynnikiem etiologicznym zapalenia przyzębia są bakterie, głównie gram-ujemne, tworzące płytkę nazębną. Największe znaczenie w rozwoju paradontozy mają bakterie z tzw. "czerwonego kompleksu", w skład którego wchodzą Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola i Tannerella forsythia. Ostatni z wymienionych gatunków jest najsłabiej poznanym peridodontopatogenem tego kompleksu. Dwa lata temu został odkryty nowy potencjalny czynnik wirulencji Tannerella forsythia - metaloendopeptydaza karilizyna. Jest to 52 kDa wielodomenowe białko, ulegające auto-obróbce proteolitycznej do dojrzałej formy (Kly18). Niniejsza praca jest poświęcona wpływowi jonów dwudodatnich (cynku, wapnia i magnezu) na aktywność dwóch form karilizyny (proKly oraz Kly18). W tym celu otrzymano rekombinowane formy karilizyny , które następnie pozbawiono jonów dwudodatnich za pomocą EDTA. Następnie zbadano wpływ jonów dwudodatnich (Zn2+, Ca2+, Mg2+) na aktywność proteolityczną proKly i Kly18. Przeprowadzone badania wykazały, że jony cynku mają różny wpływ na obie formy karilizyny. Aktywność proKly została przywrócona poprzez ponowne dodanie jonów cynku, jednakże w przypadku Kly18 nie udało się przywrócić aktywności początkowej. Ponadto udowodniono, że aktywność proKly wysyconej jonami cynku może zostać zwiększona dodatkowo poprzez dodanie jonów wapnia. Dowiedziony został także brak wpływu jonów magnezu na aktywność zarówno proKly, jak i Kly18.Periodontitis is a chronic inflammatory disease, characterized by progressive destruction of tooth connective tissues. The primary etiological factor of periodontitis are gram-negative bacteria which form dental plaque. The most important in progression of periodontitis are bacteria from so called "red complex", which includes Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia. The latter species mentioned is the least met periodontal pathogen of this complex. Two years ago a new potential virulence factor of Tannerella forsythia - metallopeptidase karilysin was discovered. It is a 52 kDa multi-domain protein, going through proteolytic auto-processing to mature form (Kly18).The main objective of this thesis is to demonstrate the effect of the two-positive ions on two forms of karilysin (proKly and Kly18). Two recombined forms of karilysin were obtained, and with the help of EDTA they were taken away of the two-positive ions. Next, the effect of the two positive ions (Zn2+, Ca2+, Mg2+) on proteolytic activity of proKly i Kly18 was examined. The research has shown that the zinc ions have different effect on the forms of karilysin. The proKly activity was restored by re-addition of zinc ions, however the initial activity of Kly18 could not be restored. It was demonstrated that proKly activity saturated with the zinc ions could be increased with the addition of the calcium ions. It was also proven that the ions of magnesium had no effect on neither the activity of proKly or Kly18