The influence of olfactory bulbectomy and amitriptyline on calretinin neurons in the rat's prefrontal cortex.

WPROWADZENIE: Etiologia zaburzeń depresyjnych, pomimo wielu lat badańpróbujących wyjaśnić mechanizm jej powstawania, wciąż pozostaje niejasna. Obecnie, wielu badaczy podkreśla znaczną rolę przewlekłego stresu w wystąpieniu zaburzeń funkcjonowania kory mózgowej, a w szczególności kory przedczołowej. Dochodzi do znacznego osłabienia homeostatycznych mechanizmów neurotroficznych, licznych zmian degeneracyjnych oraz przebudowy połączeń neuronalnych, prowadząc do wyraźnej dysfunkcji wyższych czynności korowych. Patofizjologia depresji jest ściśle związana z nieprawidłowym funkcjonowaniem układów neuroprzekaźników. Przypuszcza się, iż decydujący wpływ wykazuje hamujące przekaźnictwo GABA-ergiczne. Kalretinina, należąca do grupy białek wiążących wapń (CaBPs) jest swoistym markerem populacji interneuronów GABA-ergicznych. Ulegając ekspresji w komórce nerwowej zabezpiecza ją przed cytotoksycznym działaniem jonów wapnia pełniąc funkcje ochronne.CEL: Celem niniejszej pracy była analiza neuronów CR+ pod względem ich gęstości numerycznej, immunoreaktywności oraz wielkości perikarionów. Analizę przeprowadzono w obrębie środkowej części kory przedczołowej (mPFC) u szczurów poddanych uprzednio zabiegowi chirurgicznemu – bulbektomii opuszek węchowych. Badano również działanie leku przeciwdepresyjnego – amitryptyliny, która była podawana zwierzętom po bulbektomii.MATERIAŁ I METODY: Materiałem badawczym były tkanki mózgowe pochodzące od 24 szczurów rasy Wistar, które utworzyły 4 równe grupy doświadczalne: kontrolną (K), grupę poddaną bulbektomii (B), grupę przyjmującą amitryptylinę w odpowiedniej dawce (A) oraz grupę po zabiegu bulbektomii, przyjmującą następnie amitryptylinę (B+A). W celu określenia reaktywności oraz lokalizacji komórek CR+ wykorzystano metodęimmunocytochemiczną LAB-SA z użyciem mysich przeciwciał poliklonalnych przeciwko kalretininie firmy Millipore w rozcieńczeniu 1:200. Po przeprowadzeniu reakcji dokonano przeliczeń gęstości numerycznej neuronów CR+ na 0,1 mm2 powierzchni. Pomiary mikrodensytometryczne wykonano przy użyciu komputerowego analizatora obrazu mikroskopowego, różnicującego 256 stopni gęstości optycznej. Analizastatystyczna, której poddano otrzymane wyniki pozwoliła na obliczenie średniej arytmetycznej, wartości minimalnej, maksymalnej oraz błędu standardowego średniej z wykorzystaniem programu Statistica 11.0. Następnie zastosowano nieparametryczny test ANOVA Kruskala – Wallisa oraz test post - hoc Dunna w celu oceny różnic pomiędzy badanymi grupami doświadczalnymi.WYNIKI: Bulbektomia wywołała istotny statystycznie (p < 0,001) 66% spadek gęstości numerycznej neuronów CR+ w porównaniu z grupą kontrolną. Ubytek neuronów dotyczył głównie warstwy powierzchniowej i wewnętrznej mPFC. Podanie amitryptyliny w pewnym stopniu odwracało zmiany wywołane bulbektomią. Wykazano 54% wzrost gęstości neuronów CR+ (p < 0,01) zwłaszcza w warstwie powierzchniowej oraz wewnętrznej. W grupie zwierząt poddanych bulbektomii wykazano tendencję wzrostowąudziału procentowego neuronów dużych o powierzchni powyżej 113,74 μm2 kosztem komórek małych i średnich. Nie były to jednak różnice istotne z statystycznego punktu widzenia. Wykazano także ujemną korelację (r = -0,553; p < 0,001) dla grupy B, pomiędzy powierzchnią neuronów CR+ a ich gęstością numeryczną. Nie wykazano zmian w immunoreaktywności ogólnej populacji komórek CR+, natomiast zaobserwowano je w przypadku neuropilu (p < 001). Doszło tu do 7% spadku reaktywności po bulbektomii w stosunku do grupy K (p < 0,05) oraz 14% wzrostu po podaniu amitryptyliny (p < 0,001).WNIOSKI: Uzyskane wyniki oraz ich analiza statystyczna wykazały znaczny spadek gęstości numerycznej neuronów CR+ w grupie zwierząt poddanych bulbektomii oraz tendencję wzrostu udziału procentowego neuronów CR+ o dużej powierzchni i stosunkowo wysokiej immunoreaktywności kosztem neuronów małych oraz średnich. Jest to prawdopodobnie efektem zaburzenia procesów plastyczności neuronalnej.INTRODUCTION: Despite the years of research, trying to explain the mechanism of depression generation, the etiology of this mood disorder is still unclear. Currently, many researchers underline the role of chronic stress in the occurrence of the cerebral cortex disturbances, particularly prefrontal cortex. This leads to significant weakness of the homeostatic neurotrophic mechanisms, degenerative changes and remodeling of neuronal connections, leading to visible dysfunction of cerebral cortex. The pathophysiology of the depression is connected with the malfunctioning of neurotransmitter systems. It’s believed that major influence’s got inhibitory GABA-ergic system. Calretinin, which belongs to a group of calcium-binding proteins (CaBPs) is a specific marker of GABA interneurons population. It’s neuron’s expression helps protect cell from the cytotoxic effects of calcium ions.AIM: The aim of this study was to analyze the CR+ neurons according to their numerical density, immunoreactivity and pericarion’s size. The analysis was concern on the central part of the prefrontal cortex (mPFC) in olfactory bulbectomized rats. The effect of amitriptyline administration in bulbectomized animals also was analized.MATERIALS AND METHODS: The material was derived from brains of 24 rats, Wistar breed, which created 4 equal experimental groups: control (K), the group of rats after bulbectomy (B), the group receiving the appropriate dose of amitriptyline (A) and the group first subjected to bulbectomy and then receiving amitriptyline also in appropriate dose (B + A). To determine the immunoreactivity and the location of CR+ nerve cells, the immunocytochemistry method LAB-SA was used with mice, polyclonal antibodies against calretinin, produced by Millipore company at the dilution: 1:200. After the reaction, was made the numerical calculation of the density of CR+ neurons to 0,1 mm2 area.RESULTS: Bulbectomy caused statistically significant (p < 0,001) 66% decrease of CR+ neuron numerical density compared to the control. Main neuronal loss was observed in the surface and internal layer of mPFC. Administration of amitriptyline reversed the changes induced by bulbectomy. It was showed 54% increase in the density of CR+ neurons (p < 0,01), especially in the surface and internal layer. In the group of bulbectomized animals was showed an upward trend of the neurons percentage with an area larger than 113,74 μm2 at the expense of small and medium-sized cells. There was also showed a negative correlation (r = -0,553; p < 0.001) in group B, between the surface of CR+ neurons and their numerical density. There were no changes in the immunoreactivity of the general CR+ cells population, whereas it was observed in the case neurophil (p < 001). There was observed 7% decrease of reactivity after bulbectomy compared to the group K, and 14% growth after amitriptyline administration.CONCLUSIONS: Achieved results and their statistical analysis showed a significant decrease of CR+ neurons number in the group B and the upward trend in the percentage of CR+ neurons with large surface area and relatively high immunoreactivity at the expense of small and medium-sized neurons. Administration of amitriptyline reversed changescaused by bulbectomy, leading to increase in density of CR + neurons, particularly in the internal and surface layer