Production of recombinant Staphylococcus aureus serine protease for proteomic analysis

Najlepiej poznaną i najliczniejszą grupą proteaz są proteazy serynowe. Odgrywają one znaczącą rolę w funkcjonowaniu organizmów, między innymi u ssaków biorą udział w procesach fizjologicznych takich jak: trawienie białek w układzie trawiennym, kaskadzie krzepnięcia krwi, czy w zapłodnieniu. Glutamyloendopeptydaza (Glu-C) należy do proteaz serynowych produkowanych przez gatunek Staphylococcus aureus. Proteaza ta wykazuje wysoką specyficzność, hydrolizując wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszt kwasu glutaminowego i asparaginowego. Determinantą specyficzności enzymu Glu-C jest N-końcowa reszta waliny 69, która pozwala na lokowanie się w kieszeni reszt aminokwasowych posiadających w łańcuchu bocznym grupę γ-karboksylową. W części doświadczalnej niniejszej pracy przedstawiono sposób konstrukcji szczepu S. aureus BARS4, który wykazywał znaczną nadprodukcję rekombinowanej glutamyloendopeptydazy posiadającej motyw polihistydynowy na C-końcu. Gen proteazy Glu-C znajdował się po kontrolą konstytutywnego promotora P2. Sekwencja promotorowa pochodzi ze szczepu S. aureus CH91, u którego reguluje ekspresję stafopainy A2. Zastosowanie układu homogenicznego zapewniło uzyskanie aktywnej formy rekombinowanej proteazy w płynach pohodowlanych. Zastosowany szczep gronkowcowy posiada wyłączony natywny gen protezy Glu-C (sspA), co umożliwiło uniknięcie zanieczyszczenia uzyskanego preparatu rekombinowanej Glu-C natywną formą tego enzymu. Wprowadzony motyw polihistydynowy pozwolił na jednoetapowe oczyszczenie rekombinowanej glutamyloendopeptydazy. Ze 100 ml hodowli S. aureus BARS4 uzyskano 15 mg białka o wysokiej czystości. Aktywność uzyskanego preparatu rekombinowanego enzymu jest porównywalna z aktywnością komercyjnie dostępnej glutamyloendopeptydazy. Co więcej, rekombinowana proteaza Glu-C wykazuje specyficzność głównie względem reszt kwasu glutaminowego i asparaginowego.Uzyskany preparat rekombinowanej glutamyloendopeptydazy produkowanej przez szczep S. aureus BARS4 nadaje się do zastosowania w badaniach proteomicznych.Serine proteases are the best characterised and the largest group of proteases. Serine proteases play a significant role in organism functioning. In mammals they are involved in physiological processes such as protein digestion in the gastrointestinal tract, coagulation cascade and fertilisation. Glutamyl endopeptidase (Glu-C) is a serine protease produced by Staphylococcus aureus species. Glu-C protease specifically cleaves peptide bonds after glutamic and aspartic acid residues. N-terminal Valine 69 determines substrate-specificity of the enzyme, allowing for bonding of amino acid residues with γ-carboxyl group to active site of the enzyme.In the experimental part of this thesis it was shown how the strain S. aureus BARS4 was constructed. The strain S. aureus BARS4 shows high overproduction of recombinant glutamyl endopeptidase, which has a polyhistidine-tag at its C-terminal end. Gene of recombinant protease Glu-C was under control of the constitutive promoter P2. Promoter sequence was derived from S. aureus strain CH91 where it regulates expression of stafopain A2. Application of the homogeneous system enabled production of the active form of the recombinant protease into liquid medium. The applied S. aureus strain has a knock-out on the native sspA, which allows to avoid contamination of recombinant enzyme preparation with native glutamyl endopeptidase. Polyhistidine-tag attached to C-terminal end of protease enabled for one-step purification of recombinant protein. 15 mg of recombinant protein of high-purity was purified from 100 ml of the cell culture. The activity of obtained recombinant enzyme preparation is comparable to the activity of commercially available glutamyl endopeptidase. Moreover, recombinant protease Glu-C preferentially recognises glutamic and aspartic acid residues. The recombinant glutamyl endopeptidase preparation form S. aureus BARS4 is suitable for applications in proteomic analysis