Protochlorophyllide oxidoreductase - ligands interactions. A preliminary study.

Oksydoreduktaza protochlorofilidu (POR) przeprowadza jedną z ostatnich reakcji szlaku biosyntezy chlorofilu. Enzym ten w obecności światła katalizuje redukcję jednego z podwójnych wiązań pierścienia tetrapirolowego protochlorofilidu (Pchlidu), utleniając NADPH. W celu zbadania procesu wiązania barwnika do białka POR, opracowano model homologiczny białka PORA z Arabidopsis thialiana, a także otrzymano czyste i aktywne białko, ekspresjonowane w bakteriach Escherichia coli. Udało się odtworzyć charakterystyczny dla układów in vivo stan skompleksowania Pchlidu w postaci oligomerycznych kompleksów (Pchlid:PORA:NADPH)n bez udziału lipidów, PORB i Pchlidu b. Zaproponowano parametr określający stopień oligomeryzacji POR, którym był stosunek intensywności fluorescencji przy 660 nm do 630 nm, mierzonych przy wzbudzeniu falą o dł. 440 nm (I660/I630). W badanych warunkach, przy niedoborze barwnika względem enzymu, parametr ten był zależny liniowo od logarytmu dziesiętnego z ilorazu stężeń [Pchlid]:[POR]. Na podstawie opracowanego modelu wytypowano także reszty aminokwasowe, prawdopodobnie istotne w procesie wiązania barwnika. Otrzymano muteinę PORA-TT316/317AA, która miała niższy parametr opisujący zdolność do kompleksowania Pchlidu (I660/I630). Mutacja nie wpływała na wydajność redukcji barwnika. Na podstawie modelu i wyników eksperymentalnych zaproponowano, że reszty TT316/317, oddziałując z pierścieniem nikotynamidowym NADPH, stabilizują kieszeń wiążącą Pchlid.Protochlorophyllide oxidoreductase (POR) catalyses one of the last step of biochemical pathway of chlorophyll biosynthesis. In this light-induced reaction, one double bond of tetrapyrrole ring of protochlorophyllide (Pchlide) is reduced. During the same reaction one molecule of NADPH is oxidized. In order to analyze the process of pigment binding to POR, a homology model of PORA from Arabidopsis thaliana was obtained. Moreover, this enzyme was successfully purified from Escherichia coli expression system. It has been shown in this work, that (Pchlide:PORA:NADPH)n oligomers can be formed without lipids, Pchlide b or PORB in the reaction mixture. A new parameter – I660/I630 – which is the ratio of fluorescence intensity at 660 nm to that at 630 nm (read from the fluorescence spectrum measured for the excitation at 440nm) was proposed to describe the level of POR oligomeryzation. This parameter was linearly dependent on decimal logarithm of the [Pchlid]:[POR] ratio, for [Pchlid]:[POR] ratio < 1. Some residues of POR enzymes were suggested to be involved in Pchlide binding. The mutated protein PORA TT316/317AA was obtained. In this mutant, the pigment binding was weaker then in the wild type, but the mutation did not affect its catalytic properties. According to the homology model and the experimental data it was proposed that TT316/317 residues interact with nicotynamidic ring of NADPH and this interaction stabilizes the pigment-binding pocket