Developing a system of expression, purification and crystallization of a serine protease SplF Staphylococcus aureus.

Gronkowiec złocisty jest niebezpiecznym ludzkim i zwierzęcym patogenem. Kolonizuje on bezobjawowo ponad połowę ludzkiej populacji, zasiedlając głównie śluzówki jamy nosowej i gardła. Jednocześnie jest przyczyną większości zakażeń wewnątrzszpitalnych, a także wielu zakażeń pozaszpitalnych. Jego oporność na obecnie dostępne antybiotyki ciągle wzrasta, a co za tym idzie już obecnie istnieją duże trudności w leczeniu infekcji wywołanych przez S. aureus. Sytuacja ta wymaga opracowania nowych metod terapii antygronkowcowych do czego niezbędne jest poznanie fizjologii oraz szlaków chorobotwórczości tego patogenu. Gronkowiec złocisty wytwarza całą gamę czynników wirulencji. Stanowią one część integralną struktur komórki jak na przykład kwasy tejchojowe, białko A, peptydoglikany oraz czynniki wirulencji wydzielane na zewnątrz komórki do których należą m.in. peptydaza V8, toksyna epidermolityczna, czy stafopainy. Mimo wieloletnich badań wciąż niewiele wiadomo o sześciu peptydazach zgrupowanych w operonie spl. Znajdują się one w obrębie tzw. wyspy patogenności i na tejże podstawie sugeruje się, że białka Spl stanowią niezbadane jak dotąd czynniki wirulencji gronkowca złocistego.Niniejsza praca ma na celu charakterystykę jednej z peptydaz operonu spl, białka SplF. Przedstawiono wyniki testów ekspresji białka SplF. Z powodu trudności w otrzymaniu natywnej peptydazy, docelowo ekspresjonowano białko z mutacją jednego z trzech aminokwasów znajdujących się w centrum katalitycznym (histydyna została zamieniona na alaninę). Oczyszczoną peptydazę poddano próbom krystalizacji. Uzyskane wstępnie kryształy optymalizowano. Efektem pracy było otrzymanie kryształu o odpowiedniej wielkości i regularnym kształcie, który został wykorzystany do pomiarów dyfraktometrycznych i rozwiązania struktury peptydazy SplF.Staphylococcus aureus is a dangerous human and animal pathogen. It colonizes asymptomatically over half of the human population, inhabiting mainly the mucosa of the nasal cavity and throat. At the same time Staphylococcus is the major cause of nosocomial infections and community acquired infections are frequent. Its resistance to currently available antibiotics is still increasing, what causes difficulty in treating infections caused by S. aureus. In this situation there is an urgent need to comprehensively recognize the physiology and pathogenesis of this bacteria in order to develop new therapies against staphylococcal disease. Staphylococcus aureus produces multiple different virulence factors. Some are integral part of the cell structures such as teichoic acids, protein A, peptidoglycan. Others are secreted outside the cell, e.g. V8 protease, epidermolytic toxins or staphopains. Despite of substantial body of research little is known about the six proteases grouped in the spl operon. The Spl protease encoding genes are located on one of staphylococcal pathogenicity islands which is the basis of a hypothesis that these enzymes are as yet unexplored virulence factors of Staphylococcus aureus.This study aimed to determine the characteristics of a protease encoded in the spl operon, namely SplF protease. The results of initial tests of SplF protein expression are presented. Because of encountered difficulties in obtaining native proteinases, a protein with a mutation in one of three amino acids located in the catalytic center (histidine was changed to alanine) was produced. The purified mutein was subjected to crystallization screening, and the obtained initial crystals were thoroughly optimized. As a result of this study crystals of suitable size and regular shape were obtained, which were used for X-ray diffraction measurements. The collected data allowed to solve the crystal structure of SplF protease