Studies on the prediction of the type of chromatin conformation in the live prophase mouse oocytes.

Izolowane z jajnika profazowe oocyty myszy wykazują dwa typy konformacji chromatyny – typ SN i NSN, przy czym konformacji NSN towarzyszy obniżenie zdolności rozwojowych oocytów. Założeniem pracy było skonstruowanie metody, która w najbardziej skuteczny sposób pozwoli przyżyciowo oddzielić oocyty NSN i SN. Przetestowano skuteczność predykcji konformacji chromatyny w oparciu o trzy techniki. Pierwsza metoda polegała na predykcji konformacji chromatyny w oparciu o obecność przestrzeni pomiędzy oolemmą a osłonką przejrzystą (PVS) w oocytach inkubowanych w obecności cytochalazyny D. Wykazano, iż wszystkie oocyty, które nie tworzą PVS po 45 minutach inkubacji posiadają konformację typu NSN. Jednakże, oocyty takie stanowią nieliczna frakcję, co czyni tą metodę mało wydajną. Znacznie wydajniejsza okazała się metoda predykcji konformacji chromatyny w oparciu o wielkość oocytów dająca 81% konformacji NSN w grupie oocytów najmniejszych i 81% konformacji SN w grupie oocytów największych, jednakże przy braku wyraźnej korelacji w grupie oocytów o pośredniej wielkości. Trzecia metoda, polegająca na przyżyciowym barwieniu komórek barwnikiem fluorescencyjnym – Hoechst 33342, dała najlepsze wyniki, gdyż ustalona w ten sposób konformacja chromatyny nie odbiegała znacząco od rzeczywistej. Stosując tą metodę uzyskujemy nie tylko najlepszą prognozę ale również największy odzysk oocytów. Działanie promieniowania UV, na które wystawione były badane komórki upośledzało jednak ich dojrzewanie mejotyczne. Z tego powodu metoda ta ma ograniczoną wartość dla oocytów przeznaczonych do dalszej hodowli in-vitro.Mouse prophase oocytes posses two alternative types of chromatin conformation – SN and NSN, and this latter correlates with the reduced developmental potential. The aim of this work was to develop a method that allows in the most efficient way to predict the type of chromatin conformation in the live oocytes. The first method tested whether the formation of the perivitelline space (PVS) in the oocytes incubated in the presence of cytochalasin D correlates with the type of chromatin conformation. All oocytes which did not from PVS after 45 minutes incubation had NSN conformation. However, such oocytes represent very small fraction of the whole population of the isolated oocytes, which makes this method very inefficient. In the second method oocytes were classified into three size groups before fixation. The fraction of small oocytes yielded 81% of NSN conformation and the fraction of large oocytes yielded 81% of SN conformation, whereas in the fraction of oocytes of intermediate size no distinct correlation was noted. The third method, which comprised intravital staining of the cells with a fluorescent dye – Hoechst 33342, has proven to be the best for predicting oocyte chromatin conformation, because the results did not differ significantly from the real conformation of chromatin verified in fixed cells. Using this method, we get not only the highest level of prediction but also the largest oocyte recovery. However, this method requires the exposure of Hoechst 33342 stained oocytes to UV radiation which highly impaired their meiotic maturation. For this reason, this method is not suitable for use on oocytes destined for further in-vitro culture