The influence of immunosuppressive environment on glycosylation profile of human immune cells in MLR culture.

Glikozylacja białek jest istotna dla prawidłowego funkcjonowania układu odpornościowego człowieka. Reszty cukrowe receptorów powierzchniowych obecnych w obrębie synapsy immunologicznej uczestniczą w rozpoznawaniu się komórek, modulują siłę oddziaływań adhezyjnych tworząc przestrzeń między komórkami, w której ma miejsce prezentacja antygenu, zabezpieczają przed niespecyficzną agregacją receptorów TCR w błonie komórkowej limfocytów T oraz chronią przed proteolizą w przypadku dłuższego kontaktu komórek układu immunologicznego. Glikozylacja jest procesem bardzo wrażliwym na szereg różnych czynników wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. W procesie dojrzewania, różnicowania oraz aktywacji limfocytów T i komórek dendrytycznych mają miejsce zmiany glikozylacji białek powierzchniowych. Liczne badania wykazały również tendencję do zmian strukturalnych glikokoniugatów w różnych stanach chorobowych. Poznanie tych zależności może być również ważne w leczeniu immunospresyjnym stosowanym po przeszczepach narządów, dlatego celem niniejszej pracy była analiza glikozylacji leukocytów jednojądrzastych w obecności leków immunosypresyjnych, rapamycyny i cyklosporyny. Materiałem badawczym były traktowane immunosupresantami komórki pochodzące z dwukierunkowej mieszanej hodowli MLR. Analizę glikozylacji wykonano stosując lektyny pochodzenia roślinnego specyficznie rozpoznające określone reszty cukrowe w metodzie Western Blottingu oraz cytometrii przepływowej. Metodą lektynoblottingu wykazano zwiększenie ekspresji struktur wielomanozowych N-glikanów oraz fukozylacji w dwóch białkach o masach 45kDa i 50kDa pod wpływem cyklosporyny oraz białku o masie 58kDa w obecności obu leków zastosowanych równocześnie. Cyklosporyna zwiększała również ekspresję strukur polilaktozminylowych, działając na większość białek o 2-3 powtórzeniach laktozaminy oraz białka o masie 52kDa i 58kDa zawierające więcej powtórzeń tego disacharydu. W przypadku O-glikanów obserwowano zwiększenie intensywności antygenów T i Tn w białkach o masach 116kDa i 102kDa. Również analiza ilości komórek o danym typie struktur i średniej intensywności fluorescencji metodą cytofluorymetryczną wykazała zmiany glikozylacji będące efektem działania rapamycyny i cyklosporyny. Uzyskane wyniki wskazują, że efekt działania leków immunosupresyjnych jest znacznie szerszy niż dotychczas sądzono oraz rodzą kolejne pytania o mechanizm zachodzących zmian glikozylacji oraz ich znaczenie funkcjnalne.Glycosylation of proteins is important for the proper functioning of the human immune system. Sugar residues of surface receptors present in immune synapse are involved in the recognition of cells, modulating the strength of adhesive interactions between cells creating a space in which takes place the presentation of antigen, are protecting against non-specific aggregation of TCR receptors in the cell membrane of T cells and against proteolysis in the case of prolonged contact with immune system cells. Glycosylation is a process that is very sensitive to a variety of intracellular and extracellular factors. In the process of maturation, differentiation and activation of T cells and dendritic cells, there are changes of surface protein glycosylation. Numerous studies have also shown a tendency of structural changes of glycoconjugates in various disease states. Understanding these relationships may also be important in the immunosuppressive treatment used after organ transplant, that is why the aim of this study was to analyze glycosylation of mononuclear leukocytes in the presence of the immunosuppressive drugs rapamycin and cyclosporine. Immunosuppressant treated cells from two-directional MLR mixed culture were the research material. The analysis of glycosylation was performed using plant origin lectins that specifically recognize sugar residues in methods of Western Blot and flow cytometry. The lectinblotting showed an increase of the expression of high-mannose N-glycan structures and fucosylation of the 45 kDa and 50kDa proteins treated with cyclosporin and 58kDa protein treated with both immunosuppressive drugs. Cyclosporine also increased the expression of polilactosamine structures, acting on a majority of 2-3 lactosamine repetitions proteins and proteins weighing 52kDa and 58kDa containing more repeats of this disaccharide. In the case of O-glycans, an increase in intensity of the T and Tn antigens in proteins with masses of 116kDa and 102kDa was noted. Also, analysis of the number of cells of a given type of structure and the average fluorescence intensity by flow cytometric analysis revealed changes in glycosylation which result from action of rapamycin and cyclosporine. The results indicate that the effect of immunosuppressive drugs is much broader than previously thought and raise further questions about the mechanism of change of glycosylation and the functional significance of these changes