Development of a 3D cell model to study inflammation and photo sensitization processes of the skin

Komórki endotelialne jako pierwsze uczestniczą w tworzeniu zrębu komórkowego podczas rozwoju guza. Biorą one udział w procesie angiogenezy, który jest kluczowym etapem w przemianie guza z formy łagodnej do złośliwej. Zachodzi to w wyniku: 1.rekrutacji pobliskich komórek endotelialnych. 2. rekrutacji progenitorowych komórek endotelialnych z szpiku kostnego. Co więcej, ostatnie doniesienia sygnalizują rolę różnorodnych komórek z mikrootoczenia guza w promowaniu powyższych procesów poprzez wydzielanie specyficznych chemokin.Czerniak, jako wysoce niebezpieczny nowotwór skóry charakteryzujący się częstymi przerzutami, powinien być prawidłowo zbadany pod względem rozwoju jego unaczynienia. W tym celu zbudowaliśmy trójwymiarowy model komórkowy, w którym rekrutacja komórek endotelialnych przez guza oraz proces jego unaczynienia może być badany in vitro za pomocą wideo-mikroskopu. Wykorzystaliśmy komórki melanomy mysiej (komórki B16F10-GFP-luc) hodowane jako sferoidy. Aby modelować proces unaczynienia zastosowaliśmy progenitorowe komórki endotelialne z mysiego zarodka (MAgEC - Murine Aorta-gonad-mesonephros Endothelial Cells) oraz dojrzałe endotelialne komórki mysie płuc (Lung FVB). Zoptymalizowana macierz z żelu kolagenowego, metyl celulozy oraz MatrigelTM została wykorzystana jako środowisko migracji dla komórek endotelialnych.Potwierdziliśmy słuszność modelu, demonstrując wzmożoną rekrutację komórek endotelialnych przez komórki B16F10-GFP-luc w postaci sferoid. Następnie zbadaliśmy wpływ hipoksji, promieniowania UV oraz fotosensibilizacji. Pokazaliśmy osłabiający wpływ działania promieniowania UV oraz fotosensybilizacji na rekrutacje komórek endotelialnych przez sferoidy z komórek B16F10-GFP-luc. W warunkach hipoksycznych zauważono proangiogeniczny efekt oraz wzrost migracji progenitorowych komórek endotelialnych. Efekt ten był hamowany przez promieniowania UV, w przeciwieństwie do fotosensybilizacji, która nie miała zauważalnego wpływu.Zmierzono również produkcje chemokin w kokulturach komórek czerniaka i komórek endotelialnych, w celu zbadania komunikacji międzykomórkowej. Wykryto produkcję białek SDF-1, TARC i CX3CL1 oraz pokazano jej wzrost po działaniu promieniowaniem UV oraz fotosensybilizacji. Hipoksja również zwiększała ich produkcję, zwłaszcza w przypadku komórek po fotosensybilizacji. Nasze wyniki sugerują, że produkcja SDF-1 oraz TARC zachodziłi jedynie w obecności progenitorowych komórek endotelialnych. Podsumowując, trójwymiarowy model komórkowy wykorzystujący sferoidy może być używany jako wiarygodny model do badania nowotworów. W tej pracy zdołaliśmy potwierdzić znaczenie roli progenitorowych komórek endotelialnych w procesie unaczynienia guza. Również zademonstrowaliśmy, że w przypadku czerniaka skóry, fizjologicznie występująca hipoksja, możliwe promieniowanie UV oraz fotosensybilizacja mają znaczący wpływ na unaczynienie guza. Dlatego zwrócenie uwagi na powyższe czynniki jest konieczne dla rozwoju skutecznych terapii leczenia czerniaka.Endothelial cells are the first cells that participate in the stroma establishment in tumor development. They take part in angiogenic process, which is the fundamental step in transition of tumors from a dormant to a malignant state. It occurs as a result of:1. local recruitment of vicinal endothelial cells. 2. the distant recruitment of bone marrow endothelial precursors. Recent reports also indicate the role of various cells in tumor microenvironment in promotion of these angiogenic processes by secretion of specific chemokines. Melanoma, as highly metastatic and extremely dangerous skin cancer, needs to be properly investigated, in terms of tumor angiogenesis. We have built a 3D cellular model, in which tumor recruitment of endothelial cells and their angiogenesis can be studied in vitro using video microscopy. We used mouse melanoma (B16F10-GFP-luc cells) grown in vitro as spheroids. To mimic in vivo angiogenic processes we used precursor endothelial cells from mouse embryo (MAgEC - Murine Aorta-gonad-mesonephros Endothelial Cells) and mature endothelial cells from mouse lungs (Lung FVB). Optimized matrix consisting of collagen, methyl cellulose and MatrigelTM was used as an environment for endothelial cells migration. We have validated this model by demonstration of active recruitment of endothelial cells by B16F10-GFP-luc spheroids. The influence of hypoxia, UV irradiation and photosensitization was investigated. We have shown that UV irradiation and photosensitization of B16F10-GFP-luc spheroids decrease the recruitment of endothelial cells. On the other hand, proangiogenic influence of hypoxia was recorded, as well as, upregulation of endothelial progenitor cell migration. Although, under hypoxic conditions UV irradiation decreased endothelial cells migration and their angiogenic activity, the effect of photosensitization was negligible.Moreover, production of chemokines was measured in co-cultures of melanoma and endothelial cells to study cell-cell communication. Production of SDF-1, TARC and CX3CL1 proteins was detected and their upregulation by both UV irradiation and photosensitization was shown. Hypoxia also increased their production, particularly in cells that were photodynamically treated. SDF-1 and TARC production was shown to occur only in presence of endothelial progenitor cells. In conclusion, the 3 dimensional cellular model using spheroids can be used as reliable model to study tumor biology. In this study we were able to confirm an important role of endothelial progenitor cells in tumor angiogenesis. We have also demonstrated, that in terms of skin cancer, such as melanoma, physiologically occurring hypoxia, and possible UV irradiation and photosensitization have significant influence on this process. Therefore, consideration of these factors in development of new approaches to melanoma treatment is necessary